REPASO PRIMER PARCIAL PM

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Respecto al proceso y moléculas indicadas en la figura. Indique las opciones CORRECTAS

• E2F es un factor de transcripción que regula la expresión de genes involucrados en el pasaje de la etapa G2 a M

• Rb (retinoblastoma) fosforilado forma un complejo transcripcional activo con E2F

• La fosforilación de retinoblastoma es un evento necesario para la activación de E2F

• La expresión de un siRNA específico para Rb puede inducir la transcripción de E2F

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Con relación a la imagen presentada. Indique la opción CORRECTA y practique

• Presenta dos mecanismos alternativos de inhibición del complejo Ciclina-Quinasa dependiente de ciclina

• Es usted capaz de usar sus propias palabras para describir cada uno de ellos y a que nivel actúa p27?

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Para analizar la importancia de la expresión de FOXF1 en la resistencia que poseen células no pequeñas de cáncer de pulmón a Cisplatino, se realizó un ensayo de sobre-expresión (con un plásmido que expresa FOXF1,  FOXF1 plasmid)  e inhibición empleando un shRNA específico (FOXF1 shRNA) en células de pulmón sensibles (A549 y H1299) y resistentes a cisplatina (A549/DDP). Se analizó el efecto que los tratamientos tienen sobre dos marcadores de células madres: ALDH1 y OCT4.  De los resultados que se obtuvieron abajo se puede decir que (marque la/s opción/es CORRECTA/s):  

• La sobreexpresión de FOXF1 en células resistentes a Cisplatino reduce los niveles de los marcadores de células madres

• La transición de epitelial a mesenquimal requiere de la expresión de factores de transcripción de la familia ZEB y SNAIL

• El shRNA específico para FOXF1 en células resistentes a Cisplatino no redujo los niveles de FOXF1 pero aumentó los niveles de GAPDH

• El ensayo no se puede analizar porque los niveles de GAPDH son diferentes entre las muestras

• El shRNA específico para FOXF1 en células resistentes a Cisplatino REDUCE la expresión de marcadores de células madres

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Para confirmar la asociación entre los niveles de CREB3L1 y la inducción de la metástasis se realizaron ensayos de inhibición de la expresión de CREB3L1 en células pobremente metastásicas denominadas CAbD5 mediante el empleo de un vector lentiviral (o lentivirus) para introducir shRNA exprecífico para dismiuir (“Knock Down”) la expresión de CREB3L1 (denominadas en el gráfico como CAbD5 CREB3L1 KD). Paralelamente se analizaron como control células que no fueron tratadas con lentiviris (denominadas CAbD5) y células CAbD5 tratadas con lentivirus para incorporar un sh Control (denominadas CAbD5 sc). Con las células se realizaron primero ensayos para analizar el efecto de los shRNA (Paneles A y B) y posteriormente ensayos de migración, invasión y proliferación (paneles C a E).

A partir de los resultados presentados abajo indique las opciones CORRECTAS

• El tratamiento con shRNA específico para CREB3L1 induce disminución de los niveles proteicos de CREB3L1 en sus dos formas (procesada y no procesada o full length) respecto a las células sin tratar con lentivirus (CAbD5)

• En los ensayos de Western Blot los autores omiten mostrar el efecto del shControl sobre los niveles de CREB3L1

• Células con expresión inhibida de CREB3L1 tienen más capacidad de migración en ausencia de FBS (Suero fetal bovino) que las células control en presencia de FBS

• El tratamiento con lentivirus control afecta la capacidad migratoria e invasiva de las células CAbD5, pero no modifica la capacidad proliferativa

• Los resultados sugieren que es probable que la inhibición de CREB3L1 incremente la fosforilación de retinoblastoma y por lo tanto la actividad del factor de transcripción E2F

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Se analizó el efecto de la transfección de un vector que codifica para el factor de transcripción CREB3L1 en una línea celular de cáncer de mama altamente metastásica que posee bajos niveles de expresión endógena de CREB3L1 (LN4D6). Posteriormente se realizaron ensayos in vivo empleando un modelo de desarrollo tumoral en ratones donde se mide el volumen del tumor luego de inyectadas células LN4D6 sin transfectar (denominadas LN4D6), células LN4D6 transfectadas con el vector de expresión vacío (LN4D6 Vector) y con un vector que permite la expresión de CREB3L1 (LN4D6 CREB3L1). Se emplearon 10 animales para cada una de las condiciones y se analizó el desarrollo del tumor a diferentes días posteriores de inyección de las diferentes células. Del análisis de estos gráficos indique las opciones CORRECTAS

• El tamaño del tumor desarrollado a los 10 días es similar en todas las condiciones

• Después de 60 días de inyección de células LN4D6 (sin transfectar) el volumen tumoral desarrollado es similar respecto a las células LN4D6 transfectadas con el vector solo.

• La totalidad de los animales que recibieron células LN4D6 CREB3L1 evidenciaron disminución del volumen tumoral

• Los resultados obtenidos indicarían que CREB3L1 actúa como un oncogen

• Si se realiza un Western Blot empleando anticuerpos anti-CREB3L1 en muestras de los tres tumores, los niveles de CREB3L1 de LN4D6 CREB3L1 serían menores que LN4D6 Vector

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Respecto a los ensayos de MTT y formación de colonias.
Indique las opciones CORRECTAS

• El ensayo MTT mide la viabilidad celular basada en la actividad metabólica

• El ensayo de formación de colonias evalúa la capacidad de las células para dividirse y formar colonias

• El ensayo MTT no distingue si una célula sobreviviente podrá continuar proliferando a largo plazo.

• Ambos ensayos son equivalentes, ya que permiten obtener la misma información sobre la supervivencia celular

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Respecto a los ensayos para medir Migración e Invasión.
Indique las opciones CORRECTAS

• El ensayo de migración transwell mide la capacidad de las células de desplazarse a través de una membrana porosa sin recubrimiento

• El ensayo de invasión se diferencia del de migración porque la membrana está recubierta con matriz extracelular (ej. Matrigel), lo que evalúa la capacidad de las células de degradar y atravesar barreras

• El wound healing assay consiste en crear una “herida” en una monocapa celular y analizar la capacidad de las células de cerrar ese espacio a lo largo del tiempo

• El ensayo de wound healing es idéntico al de migración transwell, ya que ambos utilizan membranas porosas para evaluar la motilidad

• Para un análisis completo de la motilidad y el comportamiento invasivo de las células, es recomendable combinar los tres ensayos, ya que aportan información complementaria

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Respecto a lo que informa este esquema y a los contenidos teóricos del Ciclo celular .
Indique las opciones correctas

• Ciclina E se acompleja con CDK4 e induce fosforilación de Retinoblastoma

• La exposición prolongada a Rayos X induce acomplejamiento de MDM2 con P53

• p27 actúa inhibiendo por ubiquitinación la síntesis de Ciclina E

• La región promotora del gen que codifica a p21 posee elementos respondedores a p53

• por acción de p21 Rb permanece en estado hipofosforilado y fija al factor de transcripción E2F, impidiendo la transcripción de genes requeridos para la fase S

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Respecto al tema metástasis.

Indique opciones CORRECTAS

• La expresión de los factores de transcipción SNAIL y ZEB regulan positivamente la expresión de E-Cadherina

• Las mutaciones conductoras de tumor producen una ventaja de crecimiento selectivo

• E-Cadherina es una molécula que se expresa en el estado epitelial en células polarizadas

• La transición de epitelial a mesenquimal requiere de la expresión de factores de transcripción de la familia ZEB y SNAIL

• Una masa tumoral se caracteriza por su heterogeneidad genética lo que se denomina heterogeneidad intratumoral

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Se realizó un ensayo "xenograft" empleando células tumorales de cancer de colon tratadas con un shControl y un sh para inhibir la expresión de una proteína de función desconocida por la que la denominaremos Sn ???.

Marque las opciones CORRECTAS

• En el ensayo se mide el ancho de los esferoides que crecieron en una gota colocada en una tapa de placa invertida

• El grupo “shControl” tiene un crecimiento intermedio, lo que confirma que el procedimiento de transfección no altera la tumorigenicidad

• El tratamiento con el Sh ?? no puede ser analizado porque el shControl no funcionó

• El sh ??? codifica para un oncogen

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Se analizó por citometría de flujo el efecto de la sobre expresión (OE) del cDNA que codifica a LHPP en células tumorales SW480 y se obuvo el resultado indicado en la figura adjunta.
Indique las opciones Verdaderas

• Las figuras A y B son complementarias del análisis de la citometría

• La sobreexpresion de LHPP no modifica el número de células en etapa G1 (ambos picos tienen la misma altura)

• En el eje x informa sobre la intensidad del marcador que se une al DNA.

• LHPP en ese contexto actúa como gen supresor tumoral

• LHPP en ese contexto actúa como un oncogen ya que aumenta la cantidad de células en G2

SOLO PARA PRESENTAR CONCEPTOS No se evalúa, si deben entender los ensayos de tumorigenicidad

​Cómo se mide el cambio del tamaño de tumor en los ensayos previos?

🔹 Tumores subcutáneos Calibrador Vernier o pie de rey: se mide el largo (L) y el ancho (W) del tumor dos o tres veces por semana.
Se calcula el volumen tumoral con la fórmula más usada: 𝑉 = 𝐿 × 𝑊 2 2 V= 2 L×W 2 ​ (L = longitud mayor, W = ancho menor). Se grafican curvas de volumen vs tiempo, lo que permite calcular tasas de crecimiento, tiempo de duplicación o áreas bajo la curva.

🔹 Tumores ortotópicos o internos Se usan métodos de imagenología: bioluminiscencia, fluorescencia, ecografía, resonancia magnética o PET. Permiten seguir el tamaño y la progresión sin necesidad de sacrificar animales en cada punto.

Variables analizadas
Latencia tumoral: tiempo desde la implantación hasta que el tumor es detectable.
Incidencia tumoral: % de animales que desarrollan tumor.
Crecimiento tumoral: velocidad de aumento del volumen. Tamaño final o carga tumoral al finalizar el experimento.

Sabés lo que signiica subcutáneo? Ortotópico?