ABERTAS IHQ

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Descreva o método de produção de soros policlonais, indicando os tipos de soros disponíveis e formas de purificação.

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• Primeiro temos de fazer a escolha do antigénio e depois temos de fazer a sua purificação, porque este não pode ter contaminantes (se este levar contaminantes, o animal vai produzir anticorpos contra elementos não puros). Desta forma, é fundamental fazermos a purificação recorrendo a diferentes técnicas (precipitação, centrifugação, diálise, cromatografia, eletroforese)

• O antigénio purificado é injetado no animal escolhido (o coelho, mais frequentemente, mas também pode ser a cabra, o porco, a ovelha, o cavalo) e as injeções devem ser repetidas em intervalos regulares, de modo a manter a concentração de Ac específicos alta

• Ao fim de algumas semanas, é colhido o sangue do animal testado, normalmente sem o sacrificar

• Posteriormente fazemos a separação do sangue e centrifugamos (nesta técnica podemos obter 3 tipos de soros)

• - Soro total: possui diversos Ac e proteínas circulantes (albumina, alfa e beta globulinas)

• Podemos continuar o processo de purificação e realizar a separação de outras proteínas, eliminando as proteínas que não são imunoglobulinas, por processos de precipitação salina ou cromatografia de troca iónicao

- Fração de Igs: possui diversos Ac específicos e não específicos

• Por fim, podemos realizar a separação de outras Ac, através da realização da cromatografia de afinidade e técnicas de absorção por fase sólida ou líquida

- Soro de afinidade isolada: possui Ac específicos e vestígios de contaminantes (este soro é o mais puro a que se pode chegar)

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Complete o seguinte quadro de forma que todos os elementos correspondam entre si corretamente e rentabilizando os soros ao máximo (Nota: por cada lâmina preparar 100 μL de soro e pipetar somente valores inteiros)

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Qual é a diluição ideal de AC?

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É considerada diluição ideal de um soro a diluição que permite a maior intensidade de marcação com o menor fundo possível. A diluição representa-se por: X/Y; sendo que X= [partes de soro concentrado] e Y= [partes de solução final].

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Quais as principais ações do fixador que o tornam imprescindível na técnica histológica?

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A fixação é uma das mais importantes fases da preparação da amostra, sabendo que a sua principal finalidade é manter as células e os tecidos o mais próximo possível das características in vivo, assegurando:

• Preservação –as enzimas endógenas e a flora microbiana ficam impedidas de destruir o tecido;

• Estabilização –a estrutura molecular do tecido é estabilizada;

• Proteção –o fixador protege ainda os tecidos e as células das agressões do procedimento histológico e coloração.

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É contactado no sentido de criar um protocolo para aplicação de Imunocitoquímica em exames extemporâneos. Que estratégias do ponto de vista prático utilizaria de forma a responder de forma eficiente a este desafio?

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Uma vez que queremos um protocolo para aplicar em casos de exames extemporâneos, o método terá de ser rápido e sensível, pelo que, para tal, podemos aplicar o método do polímero.

Este é um método que,

através da utilização de polímeros, permite-nos conjugar grandes quantidades de marcador a anticorpos e aumentar, assim, a intensidade da marcação.

Posto isto, é um método muito ampliativo, que apresenta muitas moléculas propiciadoras de visualização por molécula de antigénio e, simultaneamente, é um método rápido e simples (apresenta poucas etapas), evidenciando uma diminuição de fatores de erros.

Assim, como temos presente um grande número de enzimas no polímero, uma maior quantidade de cromogéneo será precipitada, o que resulta numa marcação mais intensa e brilhante, aumentando assim a sensibilidade do método, permitindo detetar até as quantidades mais ínfimas de antigénio.

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Explique a reação entre a HRP e a 3,3-diaminobenzidina tetrahidrochloreto utilizada em Imunocitoquímica, nomeando outros intervenientes na reação e descrevendo o papel de cada um

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A HRP, em presença de peróxido de hidrogénio, forma, numa primeira fase, um complexo enzima-substrato, e, posteriormente, oxida um dador de eletrões que permite que a reação prossiga na degradação do peróxido em água e oxigénio livre. Alguns dadores de eletrões uma vez oxidados tornam-se coloridos e, portanto, são designados cromogéneos(3,3-diaminobenzidina). Este facto associado à capacidade de precipitarem no local da reação após a oxidação, torna-os muito úteis em imunohistoquímica, pois permite identificar a presença e localização do antigénio

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Explique a reação entre a fosfatase alcalina e o Fast Red TR utilizada em Imunocitoquímica, nomeando outros intervenientes na reação e descrevendo o papel de cada um.

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A enzima hidrolisa os ésteres de fosfato-naftol (substratos) em compostos fenólicos e fosfatos. Os fenóis reagem com os sais incolores de Diazonium (cromogéneo) para produzir corantes azo.Podem ser utilizadas diferentes combinações de substrato/cromogéneo como o 5-Bromo-4-Cloro Indolil Fosfato (BCIP)/Nitro Blue Tetrazolium (NBT). No caso do Fast Red TR, a fosfatase alcalina vai hidrolisaro substrato, levando à formação de um composto temporário que, posteriormente é dimerizado para produzir um corante vermelho.

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Dos estudado indique qual o tipo de controlo de qualidade que garante que uma negatividadede marcação imunocitoquímica num tumor é absolutamente verdadeira e não devido a falhatécnica nosprocedimentos. Justifique.

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O tipo de controlo de qualidade que garante que uma negatividade de marcação imunocitoquímica num tumor é absolutamente verdadeira e não devido a falha técnica nos procedimentos é o controlo interno positivo. Tal acontece, porque, este caracteriza-se por ser uma zona de tecido que tem o antigénio que queremos detetar e, simultaneamente, sabemos que esta zona foi sujeita exatamente às mesmas condições pré-analíticas que o tecido em questão. Assim, se houve marcação no controlo interno positivo e não houve na zona tumoral, podemos concluir que o antigénio que queremos procurar encontra-se em condições no tecido em questão, pelo que, a ausência de marcação no tumor significa que, de facto, o antigénio não está mesmo presente

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É consultado por um médico sobre a análise de um bloco de fígado que foi sujeito a uma fixação muito prolongada e um processamento deficiente. Estão disponíveis no seu laboratório os métodos: Strept ABC, polímero direto e PAP. Qual destes métodos seria o seu eleito? Justifique a sua escolha.

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Uma vez que o bloco de fígado foi sujeito a uma fixação muito prolongada e a um processamento deficiente tal induz uma alteração da conformação e da estrutura dos antigénios e uma degradação dos tecidos e, posteriormente, dos antigénios, respetivamente. Desta forma, optaria pelo método de StreptABC. O método do polímero direto não seria o mais indicado, uma vez que este é muito pouco ampliativo, e tendo em conta que o tecido se encontra danificado, precisamos de uma técnica mais ampliativa, para passarmos por cima deste problema.

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“Quando se seleciona uma técnica de dupla marcação para implementar num laboratório de imunocitoquímica deve-se optar pelas técnicas simultâneas devido à sua rapidez.” Comente a afirmação, analisando a sua veracidade, referindo as vantagens e desvantagens da referida técnica em comparação com outras e os seus principais passos

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A múltipla marcação pode ser feita através do método simultâneo ou do método sequencial. O método simultâneo apresenta a vantagem de ser mais rápido, mas tem as desvantagens de possuir uma planificação complicada e exige reagentes altamente específicos. Já o método sequencial apresenta as vantagens de ter uma planificação simples e não exige reagentes altamente específicos e tem como desvantagem, o facto de ser uma técnica mais demorada e trabalhosa. Desta forma, esta afirmação pode ser verdade se pretendermos obter um resultado de forma rápida, como por exemplo, no caso de exames extemporâneos. No entanto, não podemos generalizar que esta deve ser a técnica implementada pelos laboratórios, pois se, por exemplo, a rapidez com que o resultado é obtido não for tão importante, pode ser mais vantajoso optar pela técnica sequencial de dupla marcação.