Teknik Isolasi Bahan ALam

Teknik Isolasi

Isolasi Bahan Alam
dan Uji Fitokimia

Dr. Ratih Dewi Saputri, M.Si
Department Of Chemistry

Faculty of Mathematics and Natural Sciences

State University of Surabaya

• Bahan kimia yang berasal dari tumbuhan atau hewan disebut

bahan alam.

• Beberapa

kelompok

bahan

alam

ialah

lipid,

protein,

karbohidrat, alkaloid, flavonoid, terpenoid dan sebagainya.

• Simplisia Organisme Utuh

➢Tumbuhan, Hewan, Mikroorganisme

• Bagian dari Organisme

❖Daun / bunga dari tanaman
❖Organ tertentu dari hewan

• Ekstrak ataupun Eksudat/Getah
• Senyawa Murni hasil isolasi dari Organisme

❑Paclitaxel (Taxol ®) – Taxus brevifolia
❑Vitamin A dan D (Minyak Ikan)
❑Doxorubicn – Streptomyces peucetius

SIFAT

ISOLASI

FISIS

ISOLASI
KIMIA

ISOLASI BAHAN ALAM

Bahan Alam
dilakukan

berdasarkan sifat

bahan alam

tersebut, dan dapat

digolongkan

menjadi isolasi cara
fisis dan isolasi cara

kimia

Open Ended

Apa yang kamu ketahui tentang teknik isolasi bahan alam?

BERDASARKAN

KELARUTAN

PENURUNAN TEKANAN

UAP

Isolasi cara ini berdasarkan
sifat kimia atau kereaktifan

bahan alam terhadap

pereaksi tertentu. Bahan

alam diisolasi melalui reaksi
kimia dan dipisahkan dari
senyawa lain yang tidak

bereaksi.

Pemurnian

Fraksinasi

Ekstraksi

➢Pemilihan teknik ekstraksi bergantung pada bagian tanaman yang

akan disektraksi dan bahan aktif yang diinginkan, sehingga harus
mengetahui tujuan dari esktraksi sampel.

➢Tujuan tersebut bisa :
1. untuk memperoleh suatu bahan aktif yang tidak diketahui,

memperoleh suatu bahan aktif yang sudah diketahui,

2. memperoleh sekelompok senyawa yang struktur sejenis,
3.

memperoleh semua metabolit sekunder dari suatu bagian
tanaman dengan spesies tertentu,

4. mengidentifikasi semua metabolit sekunder yang terdapat

dalam suatu mahluk hidup sebagai penanda kimia atau kajian
metabolisme

Teknik ekstraksi yang ideal adalah teknik ekstraksi yang mampu
mengekstraksi bahan aktif yang diinginkan sebanyak mungkin, cepat,
mudah dilakukan, murah, ramah lingkungan dan hasil yang diperoleh
selalu konsisten jika dilakukan berulang-ulang

➢Maserasi dilakukan dengan melakukan perendaman

bagian tanaman secara utuh atau yang sudah
digiling kasar dengan pelarut dalam bejana tertutup
pada suhu kamar selama sekurang-kurangnya 3
hari dengan pengadukan berkali-kali sampai semua
bagian tanaman yang dapat larut melarut dalam
cairan pelarut.

➢ Pelarut

yang

digunakan

adalah

alkohol

atau

kadang-kadang juga air.

➢Cairan

yang

diperoleh

kemudian

dijernihkan

dengan

penyaringan

atau

dekantasi

setelah

dibiarkan selama waktu tertentu.

➢Keuntungan proses maserasi diantaranya adalah

bahwa bagian tanaman yang akan diekstraksi tidak
harus dalam wujud

serbuk

yang

halus, tidak

diperlukan

keahlian

khusus

dan

lebih

sedikit

kehilangan alkohol sebagai pelarut seperti pada
proses perkolasi atau sokhletasi.

Ekstrasi kontinyu dengan
pemanasan (sokhletasi)

➢Pada teknik ekstraksi ini, bagian tanaman yang sudah digiling halus dimasukkan ke

dalam kantong berpori (thimble) yang terbuat dari kertas saring yang kuat dan
dimasukkan ke dalam alat sokhlet untuk dilakukan ekstraksi.

➢ Pelarut yang ada dalam labu akan dipanaskan dan uapnya akan mengembun pada

kondenser.

➢Keuntungan dari proses ini jika dibandingkan dengan proses-proses yang telah

dijelaskan sebelumnya adalah dapat mengekstrak bahan aktif dengan lebih banyak
walaupun menggunakan pelarut yang lebih sedikit.

➢Hal ini sangat menguntungkan jika ditinjau dari segi kebutuhan energi, waktu dan

ekonomi. Pada skala kecil, proses ini hanya dijalankan secara batch. Namun, proses
ini akan lebih ekonomis jika dioperasikan secara kontinyu dengan skala menengah
atau besar.

➢Beberapa keuntungan ekstraksi sokhletasi adalah sampel bagian tanaman terus

menerus berkontak dengan embunan pelarut segar yang turun dari kondenser
sehingga selalu mengubah kesetimbangan dan memepercepat perpindahan massa
bahan aktif.

➢ Kelemahan ekstraksi dengan sokhlet ini adalah jika dibandingkan dengan teknik

ekstraksi yang lain maka teknik ekstraksi ini memerlukan ekstraksi yang panjang dan
pelarut yang banyak. Hal ini menyebabkan timbulnya biaya tambahan utnuk
membuang/mengolah

sisa

pelarut

dan

kemungkinan

terjadinya

pencemaran

lingkungan

Ekstrasi kontinyu dengan
pemanasan (sokhletasi)

Partisi

dilakukan

apabila

jumlah

komponen di dalam ektrak terdapat
puluhan

senyawa.

Dasar

dari

pemisahan dengan cara partisi adalah
perbedaan kelarutan, dan syarat yang
harus dipenuhi untuk melakukan hal
ini adalah bahwa dua pelarut yang
digunakan

tidak

saling

bercampur.

Dua

pelarut

yang

tidak

saling

bercampur adalah n-heksana-metanol,
kloroform-air, dan etil asetat-air.

PARTISI

Poll

Metode yang tepat untuk mengisolasi bahan alam yang bersifat volatif?

• Maserasi

• Sokletasi

• Destilasi Uap

• Refluks

• Kromatografi

adalah

suatu

teknik

pemisahan

molekul

berdasarkan

perbedaan

pola

pergerakan antara fase gerak
dan

fase

diam

untuk

memisahkan komponen (berupa
molekul)

yang

berada

pada

larutan. Molekul yang terlarut
dalam fase gerak, akan melewati
kolom

yang

merupakan

fase

diam.

• Kromatografi

kertas

menggunakan fase diam kertas,
yakni

kandungan

selulosa

di

dalamnya, sedangkan untuk fase
gerak yang digunakan adalah
pelarut atau campuran pelarut
yang sesuai.

• Kertas sebagai fase diam akan

dicelupkan ke dalam sampel dan
pelarut, selanjutnya sampel dan
pelarut

berdasarkan

gaya

kapilaritas

akan

terserap

dan

bergerak ke atas.

• Perbandingan jarak relatif antara

senyawa (sampel) dengan jarak
pelarut dihitung sebagai nilai Rf.

• Aplikasi

penggunaan

dari

kromatografi

kertas

sendiri

adalah

untuk

memisahkan

diantaranya

adalah

tinta,

zat

pewarna,

senyawa

tumbuhan

seperti klorofil , make up dan
berbagai zat lainnya.

Kromatografi

Kertas

Open Ended

Apa yang kamu ketahui tentang kromatografi lapis tipis?

• Kromatografi

lapis

tipis

biasanya

menggunakan sebuah lempengan tipis
yang terbalut gel silika atau alumina.

• Silika atau alumina tersebut berfungsi

sebagai fase diam. Materi lain juga bisa
digunakan sebagai fase diam asalkan
mampu

mengalami

pendarflour

(fluorescence) dalam sinar ultra violet.

• Sementara

untuk

fase

gerak

yang

digunakan

adalah

pelarut

atau

campuran

pelarut

yang

digunakan.

Aplikasi

dari

teknik

pemisahan

kromatografi

lapis

tipis

dapat

digunakan untuk mengetahui jenis pada
campuran asam amino tertentu.

Kromatografi

Lapis Tipis

Mobile

phase:

eluentStationary

phase:

silica

gel,

alumina,

Sephadex LH-20

Thin Layer Chromatography (TLC): The basis for performing the
separation of compounds will be isolated

Spot sight: UV lamp, CeSO4 reagent, anisaldehyde, Dragendorf and
so on

16

Prinsip pemisahan didasarkan atas afinitas kepolaran analit
dengan fasa diam, sedangkan fasa gerak memiliki kepolaran yang
berbeda dengan fasa diam.

Bertujuan untuk purifikasi dan isolasi

Untuk pemisahan yang bersifat preparatif,

misal : isolasi senyawa dari bahan alam/fitokimia, yang dibutuhkan
dalam jumlah besar.

Kolom berupa gelas dengan penyaring di bagian ujung bawah
kolom dan dilengkapi dengan kran, dapat pula digunakan buret
ukuran kolom, tergantung pada banyaknya zat yang akan
dipisahkan

KROMATOGRAFI KOLOM

17

PENGISIAN KOLOM

• Kolom diisi dengan zat padat (adsorben)

• Kolom harus terisi homogen, tidak ada

rongga udara (kompak)

• Pengisian yang tidak teratur →hasil

pemisahan tidak baik

• Agar kolom terisi kompak →adsorben

dibuat bubur(slurry) dengan pelarut yang
sesuai

• Slurry dituang ke dalam kolom secara

perlahan-lahan

18

PENGISIAN SAMPEL

•Sampel dibuat larutan sepekat

mungkin

(dicegah

terjadinya

pengendapan)

•Cara

memasukkan

(injeksi)

sampel di bagian atas kolom
harus

serata

mungkin

dan

dicegah

adanya

goncangan

yang

menyebabkan

rusaknya

pita-pita

19

•Elusi: membiarkan fasa gerak (eluen) turun dalam

kolom dengan membawa sampel sehingga
terjadi pemisahan komponen-komponen sampel
tersebut.

•Hasil pemisahan komponen-komponen dalam

kolom → kromatogram

•Kromatografi kolom dapat digunakan untuk

proses adsorpsi, partisi, pertukaran ion, dan
eksklusi (gel permeasi)

•Kromatografi kolom ini disebut kromatografi

kolom terbuka (konvensional)

20

PERKEMBANGAN KROMATOGRAFI

KOLOM

Perkembangan

kromatografi

kolom

berupa

kromatografi

kolom tertutup yang dikemas dalam peti baja → alat-alat
canggih :

•

GC

•

HPLC

Proses pemisahan
•Adsorpsi

: Cair- Padat (adsorben )

•Partisi

: Cair – Cair (dengan pendukung)

•Pertukaran ion

: Cair - Padat (resin penukar ion)

•Eksklusi

: Cair - Padat (gel)

Multiple Choice

Apa yang anda ketahui tentang proses pemisahan adsorbsi?

• cair-cair

• cair-padat

• padat cair

• cair-gas

21

Teknik Operasional
(Kromatografi Kolom)

22

KROMATOGRAFI

KOLOM

(

BERDASARKAN

INTERAKSI

KOMPONEN

DENGAN

ADSORBEN

)

• Komponen yang

dipisahkan secara selektif
teradsorbsi pada
permukaan adsorben

Kromatografi
Adsorbsi

• Komponen yang

dipisahkan secara selektif
mengalami partisi antara
lapisan cairan tipis pada
penyangga padat yang
bertindak sebagai fasa
diam dan eluen sebagai
fasa gerak

Kromatografi
Partisi

• Memisahkan komponen

yang berbentuk ion.
Komponen-komponen
tersebut terikat pada
penukar ion sebagai fasa
diam secara selektfi akan
terpelas/ terelusi oleh
fasa gerak

Kromatografi
Pertukaran Ion

• Kolom diisi dengan gel

yang permeabel sebagai
fasa diam. Pemisahan
berlangsung seperti
proses pengayakan yang
didasarkan atas ukuran
molekul dari komponen
yang dipisahkan

Kromatografi
Filtrasi Gel

23

Berdasarkan Gaya
yang bekerja pada

kolom

Kromatografi

Kolom

Gravitasi

Kromatografi

Kolom

Tekanan

Berdasarkan Jenis

Fasa Diam dan

Fasa Gerak

Kromatografi
Fasa Normal

Kromatografi
Fasa Terbalik

vacuum liquid column:

Sphadex LH-20:

1.Column height: 18-30 cm.
2.Sephadex LH-20
3.Column diameter adjusts to the number of

samples

4.Separation by molecular weight

1.Column height: 5-7 cm.
2. Silica gel 60
3.Column diameter adjusts

to the number of samples

• GLC

merupakan

salah

satu

jenis kromatografi gas yang
digunakan untuk memisahkan
senyawa-senyawa

organik

yang mudah

menguap. Pada

kromatografi ini, fasa gerak
yang

digunakan

adalah

gas

dan fasa diamnya adalah zat
cair.

Aplikasi

dari

kromatografi

gas

misalnya

digunakan untuk menentukan
komposisi kimia dari zat-zat
yang

tidak

kita

ketahui,

seperti

misalnya

senyawa

berbeda dalam bensin.

GLC

• Teknik pemisahan HPLC memiliki banyak

keunggulan

dibanding

dengan

kromatografi lainnya, diantaranya adalah:
cepat dalam proses analisa, resolusi yang
lebih tinggi, sensitivitas detektor yang
lebih tinggi, kolom yang dipakai dapat
digunakan kembali, ideal dan cocok untuk
zat bermolekul besar dan berionik dan
mudah untuk rekoveri sampel.

• HPLC

boleh

dibilang

sebagai

teknik

tercanggih dalam metode kromatografi.
HPLC

juga

menggunakan

sistem

instrumen seperti pada kromatogarfi gas.
Di

dalam

teknik

ini

juga

digunakan

tekanan dan kecepatan yang cukup tinggi
sehingga mampu dihasilkan resolusi yang
lebih baik.

HPLC

Sari nonpolar

• minyak

atsiri,

lemak

dan

asam

lemak

tinggi,

steroid

dan

karotenoid

Sari semipolar

• alkaloid;

senyawa

fenolik (fenol-fenol,
asam

fenolat,

fenilpropanoid,
flavonoid,
antrakinon, xanton,
stilben); komponen
minyak

atsiri

tertentu dan asam
lemak

Sari polar

• garam

alkaloid,

alkaloid

basa

kuarterner

dan

amina

teroksidasi,

antosian, glikosida,
saponin, tanin dan
karbohidrat.

Standarisasi Bahan Alam

Standarisasi

• Tujuan standarisasi adalah untuk memberikan jaminan mutu pada

produk yang dihasilkan.

Langkah-langkah

Pembakuan Sediaan Obat

Tradisional

Pembakuan Ekstrak

Pembakuan Simplisia

Pembakuan

simplisia

Pembakuan

simplisia

sebagai bahan baku obat
tradisional

merupakan

titik awal yang penting
bagi

pembakuan

obat

tradisional

secara

keseluruhan, karena obat
tradisional yang bermutu
hanya

akan

dapat

diperoleh

bila

simplisia

yang

menjadi

bahan

bakunya juga bermutu.

Pembakuan

ekstrak

Pembakuan ekstrak merupakan
hal yang penting yang harus
dilakukan

Pembakuan

ekstrak

merupakan

hal

yang

penting

yang harus dilakukan terutama
untuk tujuan memperoleh zat
identitas. Zat identitas /penanda
(marker) menjadi bagian penting
dalam penentuan standar mutu
bahan baku. Penentuan ini dapat
dilakukan melalui analisis secara
fisiko- kimia antara lain melalui
sidik jari (finger print) dalam
pola kromatografi.

Pembakuan
Sediaan Obat

Tradisional

Tiap

bentuk

sediaan

obat

tradisional

perlu

dilakukan

pembakuan

guna

memperoleh

keterulangan

dalam

identitas

bentuk sediaan. Bentuk sediaan
obat

tradisional

untuk

mempermudah

pengujian

dan

penggunaannya

dibuat

dalam

bentuk larutan, kapsul, tablet dan
lain- lain.

ALKALOID identification

[e-mail]

33

Uji Mayer :HgI2

❑ HgCl2 + KI4 (1:4)
❑ Cara : zat + pereaksi Mayer timbul endapan kuning

atau

larutan

kuning

bening

→+alakohol

endapannya larut.

Reaksi dengan asam kuat

❑ Asam kuat seperti H2SO4 pekat dan HNO3

pekat

menghasilkan

warna

kuning

atau

merah.

Reaksi Pengendapan

Uji Bouchardat

❑ I2 + KI (2:4) + aquadest
❑ Cara : sampel zat + pereaksi Bouchardat → coklat

merah, + alkohol → endapan larut.

Reaksi Warna

Reaksi Mandelin

Reaksi dengan Warna AZO

❑ Pereaksi

mandelin mengandung

amonium

vanadat dalam air ditambah H2SO4 pekat.
Sampel

ditambah

pereaksi

mandelin

berwarna kuning kehijauan.

❑ Sampel ditambah diazo A dan diazo B (4:1)

ditambah NaOH, dipanaskan lalu ditambah
amyl alkohol menghasilkan warna merah.

03/12/2
021

ALKALOID identification

Uji Dragendorf

❑ Pereaksi dragendorf mengandung bismut nitrat dan

merkuri klorida dalam nitrit berair.

❑ Ketika

suatu

alkaloid

ditambahkan

pereaksi

dragendorf

maka

akan

menghasilkan

endapan

jingga.

Gugus Benzoil

❑ Reaksi bau : Esterifikasi dengan alohol + Asam

Sulfat pekat = bau ester.

❑ Hasil positif untuk Kokain, Tropakain,k Alipin,

Stivakain, Beta eukain, dan lain-lain.

Reaksi Kristal

Uji Meyer

❑ Pereaksi meyer mengandung kalium iodida dan

merkuri klorida. Ketika sampel ditambah pereaksi
meyer maka akan timbul endapan kuning atau
larutan

kuning

bening

lalu

ditambah

alkohol

endapannya larut

Reaksi Gugus Fungsionil

Reaksi GUERRT

Gugus Amin Sekunder

❑ Alkaloida di diazotasi lalu + Beta Naftol =

merah-ungu.

❑ Hasil positif untuk kokain, Atropin, Alipin,

Efedrin, tropakain, Stovakain, Beta eukain, dan
lain-lain.

❑ Gugus Amin Sekunder

Reaksi SIMON :

larutan alkaloida + 1% asetaldehid + larutan
na (nitroprussida = biru-ungu).

❑ Hasil

cepat

ditunjukkan

oleh

Conilin,

Pelletierin dan Cystisin.

❑ Hasil lambat ditunjukkan oleh Efedrin, Beta

eucain, Emetin, Colchisin dan Physostigmin.

Uji Bauchardat

Pereaksi bauchardat mengandung kalium
iodida

dan

iood.

Sampel

ditambah

pereaksi

bauchardat

menghasilkan

endapan coklat merah.

FLAVONOID IDENTIFICATION

Uji Wilstater

This test is used to determine compounds that have d -
benzopyrone nuclei. The colors produced by the
Wilstater reaction are as follows :
❑ Jingga untuk golongan flavon.
❑ Merah krimson untuk golongan flavonol.
❑ Merah tua untuk golongan flavonon.

Uji Bate Smith Matecalve

❑ This color reaction is used to indicate the

presence of leukoanthocyanin compounds.

❑ Positive reaction if intense red to purple color

occurs

IDENTIFIKASI TERPENOID

• Ekstraksi senyawa terpenoid
• Uji fitokimia dapat dilakukan dengan

menggunakan

pereaksi

Lieberman-

Burchard.

Perekasi

Lebermann-

Burchard

merupakan

campuran

antara asam asetat anhidrat dan asam
sulfat pekat →ungu

IDENTIFIKASI STEROID

•Ke dalam gelas kimia dimasukkan 2 gram
sampel

dan

ditambah

dengan

20

mL

metanol yang mengandung 2 mL asam
sulfat dididihkan dan disaring,

•setelah itu ditambahkan 2 mL asam asetat
anhidrat,

lalu

diamati

perubahannya.

Adanya

steroid

ditunjukkan

dengan

adanya warna coklat

Multiple Choice

Bagaimana anda mengidentifikasi senyawa yang mengandung alkaloid?

• dengan pereasi dragendorf

• uji wilstater

• Uji Bate Smith

• Liebarman-Burchard

TUGAS KELOMPOK BAHAN ALAM

“ REVIEW ARTIKEL”

TOPIK

1. TEKNIK ISOLASI BAHAN ALAM

2. SENYAWA BAHAN ALAM DI TUMBUHAN

(Pilih salah satu → flavonoid, alkaloid, terpenoid,steroid,

fenil propanoid)

3. KANDUNGAN SENYAWA BIOAKTIF TUMBUHAN OBAT

INDONESIA DAN KEGUNAANNYA