Clase 4.2 Moléculas reporteras

Oráculos:
Moléculas reporteras y
funcionamiento celular

Biología Molecular II
PhD. Caroline Bacquet

Molécula reportera

En el ambiente intracelular existen un gran número de procesos

cumpliéndose continua y simultáneamente. Como se ha observado

durante este curso, genoma, proteoma, metaboloma y lipidoma
son parte esencial del funcionamiento celular. Para detectar el
funcionamiento celular se utilizan ciertas moléculas conocidas

como reporteras, capaces de detectar los procesos llevados a cabo

por estos grandes grupos moleculares.

¿Qué es un reportero?

Producen una reacción detectable,
cuantificable y específica para un proceso o estructura.

Pueden ser reporteros fluorescentes o
enzimáticos.

Es una molécula que se encarga de detectar la presencia de una

estructura o proceso

Multiple Choice

Las proteínas fluorescentes sirven para generar líneas celulares transfectadas y etiquetar proteínas de interés

• Verdadero

• Falso

Multiple Choice

Las proteínas fluorescentes son un tipo de reporteros moleculares

• Verdadero

• Falso

Utilidad de los reporteros

●Identificar elementos
genéticos que controlan la
expresión correcta de genes.

●Describir el posible destino
de desarrollo de células.

●También pueden servir para
determinar la separación de
poblaciones celulares
purificadas.

En ratones y otros organismos se han utilizado para

(Saunders 2003)

Proteínas fluorescentes

Proteína fluorescente verde (GFP)

Es la proteína fluorescente más utilizada
debido a la sencillez de su protocolo de
actividad.

Es un valioso reportero, principalmente
usado para detectar la expresión génica.

Es visible directamente en células vivas a
través de microscopía de luz
epifluorescente.

No se requieren sustratos, coenzimas,
técnicas de carga celular ni fijación para
realizar este proceso.

Multiple Choice

¿En que año se descubrió la proteína verde fluorescente?

• 1948

• 1958

• 1968

• 1978

Multiple Choice

¿Quién descubrió la proteína verde fluorescente?

• Dmitri Mendeléyev

• Martin Chalfie

• Osamu Shimomura

• Cristóbal Colón

Multiple Choice

Para adquirir su conformación fluorescente la proteína necesita de un cofactor

• Verdadero

• Falso

Otras proteínas fluorescentes

De las proteínas fluorescentes verde y roja se
han desarrollado otras proteínas con coloraciones diferentes.

La gama de azules y verdes se conoce como
derivada de GFP.

La gama de coloraciones rojizas es derivada de
RFP.

La variedad de colores permite hacer uso de
varias proteínas simultáneamente para detectar diversos procesos celulares al mismo tiempo.

Multiple Choice

Los genes reporteros pueden usarse para seguir la herencia de un transgen:

• Verdadero

• Falso

Multiple Choice

Las proteínas fluorescentes han facilitado el estudio de las redes neuronales

• Verdadero

• Falso

Reporteros enzimáticos

β-galactosidasa

El gen lacZ de Escherichia coli (que codifica
la β-galactosidasa) se usa ampliamente como
gen indicador en bacterias.

Se mide la expresión de lacZ para determinar
las fortalezas relativas de varias interacciones
proteína-ADN y proteína-proteína.

Recientemente se ha utilizado resonancia
magnética nuclear (RMN) para revelar
específicamente la actividad enzimática en
injertos de tumores humanos que crecen en
ratones. Esta técnica se realiza in vivo.

(Yu, 2012)

Multiple Choice

Tomando un plásmido que contiene el gen lacZ (b-galactosidasa). ¿Cómo seleccionarías las células que llevan el plásmido?

• Usando medio de cultivo con lactosa, las bacterias que vivan.

• Usando un medio sin lactosa, solo viven las que la producen

• Usando X-gal, las células que produzcan la enzima serán de color azul

• No se pueden seleccionar

Multiple Choice

Tomando un plásmido con el gen de la resistencia a ampicilina ¿Cómo seleccionarías las células que llevan el plásmido?

• Usando medio de cultivo con ampicilina, las bacterias que vivan.

• Usando un medio sin ampicilina, solo viven las que la producen

• Usando X-gal, las células que produzcan la enzima serán de color azul

• No se pueden seleccionar

Otras enzimas reporteras útiles

Algunas de las enzimas que se usan
como son:

●Fosfatasa alcalina

●Luciferasa

Estas enzimas causan una reacción
detectable, cuantificable y específica,
funcionando como marcadores de una
estructura o proceso.

Hay otras enzimas reporteras útiles que permiten
detectar diferentes procesos celulares y moleculares.

(Morciano et al., 2017)

Sondas lipídicas: BODIPY

Se trata de un fluoróforo, estable a
temperatura ambiente y soluble en metanol.

Esta molécula es altamente lipofílica, por lo que
se une fácilmente a moléculas de lipídicas.

Las sondas que incorporan este fluoróforo son
propensas a presentar propiedades moleculares
de lípidos naturales.

Son muy buenos marcadores para detectar el
tráfico de lípidos, así como para un uso general
en sondas de membrana celular.

Multiple Choice

Para una localización rápida de lípidos dentro de las células

• Visualización en microscopio con Rojo Nilo o Bodipy

• Cromatografía de capa fina

• Cromatografía de gases

• Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas

Sonda de calcio (KFCA)

Las sondas de calcio, conocidas en
inglés como Calcium flux assays
(ensayos de flujo de calcio), son
utilizadas para análisis de dinámicas
celulares.

Son capaces de detectar y medir la
actividad de señalización de receptores
celulares acoplados a proteína G
(GPCRs).

En neuronas, el calcio cumple un rol
fundamental en la inducción de actividad
sináptica y actividad neuronal.

(Matsui et al., 2011)

Multiple Choice

Se puede medir la concentración intracelular de Ca+2 mediante...

• Western blot

• qPCR

• Bodipy

• Fura-2

¡Gracias!