Clase 3.3 Análisis estructural y de secuencia de proteínas

Cuantificación y análisis estructurales de interacciones y secuencias proteicas

Biología Molecular II
PhD. Caroline Bacquet

Se utiliza principalmente el método de
“Salting out”, donde el principal
reactivo es el sulfato de amonio.

La sal neutra comprime la capa de
solvatación y hace que las proteínas
precipiten, permitiendo extraer el
supernadante para una siguiente etapa
de purificación o detección.

Precipitación

La precipitación consiste en la separación de proteínas de los contaminantes presentes en las células y espacios extracelulares.

Espectroscopía UV

Los residuos de tirosina y triptófano en las proteínas presentan un pico máximo de absorción en 280 nm. Gracias a ello, es posible utilizar mecanismos de espectroscopía para detectar la presencia de proteínas. Tiene ventajas al ser un método no destructivo de las proteínas. Puede presentar interferencias como la presencia de ácidos nucleicos.

Tipos de estructura

La estructura primaria se analiza la
cadena de aminoácidos que conforman un péptido.

En la estructura secundaria se
determinan las alfa hélice y hoja beta.

La estructura terciaria estudia las
atracciones entre alfa hélices y hojas beta.

La estructura cuaternaria determina la
conjunción de varias cadenas peptídicas,
que forman multímeros.

Se agrega SDS, que destruye enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas e hidrofóbicas, adicionalmente se adhiere a la proteína, dándole una carga negativa y le facilita adoptar una forma lineal.
β-mercaptoetanol rompe
enlaces disulfuro.

¿Cómo se preparan las proteínas?

(Humeco, 2020), (Puerta et al., 2015)

¿Cómo funciona?

Las proteínas son
separadas en un gel de poliacrilamida basados en su peso molecular.

Las moléculas pequeñas migran relativamente más
rápido, con respecto a las más grandes. La forma también influye: moléculas extendidas o fibrilares migran más lento que las enrolladas o globulares

Western Blot

Es una técnica molecular de
detección de proteínas que
permite identificar una proteína
de interés o varias proteínas, a
partir del uso de un anticuerpo
específico.

Se acopla a la técnica de
SDS-PAGE de separación de
proteínas. Para la transferencia se
utilizan tres mecanismos, donde
se transfiere a una membrana
contenedora de los anticuerpos.

Tras la transferencia, las
bandas resultantes son efecto
de la reacción entre el
anticuerpo y la proteína o
proteínas de interés.

La reactividad
proteína-antígeno puede ser
principalmente observada a
través de fluorescencia y
actividad enzimática.

Western Blot: Resultados

Dicroismo Circular

Es una técnica espectroscópica de
absorción que entrega información acerca de la estructura secundaria. Se basa en la propiedad que poseen algunos materiales de absorber la luz a diferentes grados dependiendo de la forma de polarización del haz de luz incidente.

Aplicaciones

● Determinación de la estructura
secundaria de proteínas

● Estudios conformacionales de proteínas
y péptidos

● Estudios de desnaturalización química o
térmica de proteínas

Cristalografía de Rayos X

Es una técnica que permite determinar la estructura atómica y molecular de un cristal u objeto cristalizado.

La estructura cristalina hace que un haz de rayos X se difracte en muchas direcciones específicas. Al medir los ángulos e intensidades de los rayos difractados se puede obtener una imagen tridimensional.

Las estructuras cristalinas de rayos X brindan información de la estructura terciaria de las proteínas, también pueden explicar las propiedades electrónicas o elásticas inusuales de un material.

Resonancia Magnética Nuclear (NMR)

Es un fenómeno físico en el cual los núcleos atómicos son perturbados por oscilaciones débiles de campo magnético y responden produciendo una señal electromagnética a una frecuencia característica. Es altamente utilizado para determinar estructuras moleculares orgánicas.

Resonancia Magnética Nuclear (NMR)

Cryo-EM: lo mejor de dos mundos

Murata and Wolf, 2018

Microscopía de fuerza atómica

Permite observar a una escala molecular
y atómica. Al tratarse de proteínas, se ha utilizado para detectar propiedades de proteínas en solución, así como de otras propiedades singulares de biomoléculas.

Se ha podido observar la topografía de la
proteína, permitiendo detectar su medida
y cantidad de proteínas en una misma
muestra.

(Pleshakova et al., 2020 & Ivanov., 2018)

03

Determinación de interacciones entre proteínas

Co-inmunoprecipitación, marcaje inmunofluorescente, FRET/FRAP.

Inmunoprecipitación

Utiliza la especificidad del anticuerpo para aislar una proteína

particular (antígeno) de una mezcla de muestra compleja.

Co-inmunoprecipitación

Esta técnica es la mejor manera de comprobar si dos proteínas están

interactuando entre sí in vivo.

Co-inmunoprecipitación

Se realiza una inmunoprecipitación, con la presunción de que la proteína objetivo, interactúa con otra proteína. Se marca y precipita una sola proteína, en el momento de analizar, se confirma la presencia de una segunda.

Resultados de co-inmunoprecipitación

Con los resultados del
Western Blot, se puede
confirmar la interacción
entre estas dos proteínas,
por la visualización de dos
bandas, o en su defecto,
descartar dicha
interacción tras observar
una sola banda.

Tinción Inmunofluorescente

Esta técnica utiliza como principio las reacciones antígeno-anticuerpo que se pueden visualizar utilizando técnicas de microscopía. El método indirecto presenta mayor sensibilidad ya que más de un anticuerpo fluorescente puede unirse al anticuerpo primario

(Humeco, 2020), (Puerta et al., 2015)

FRET y FRAP

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) es
una técnica de apagado de
fluorescencia que permite
detectar uniones de
complejos peptídicos e
interacciones proteicas.

Fluorescence resonance energy transfer
(FRET) es una técnica donde la luz de
excitación de una molécula
fluorescente (el donante) es absorbida
por una molécula aceptora, en el caso
de que se encuentre muy próxima.

Espectrometría de masas de péptidos y proteínas

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Biochimica

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