RT-PCR

No RT-PCR, a transcriptase reversa utiliza ...

• RNA como template para formar DNA

• mRNA como template para formar cDNA

• DNA como template para formar ssDNA

• DNA como template para formar mRNA

Para realizar um RT-PCR é necessário...

• solução tampão

• dNTPs

• DNA polimerase

• transcriptase reversa

O princípio da RT-PCR é...

• Detetar e medir DNA numa amostra, convertendo-o em RNA e amplificando-o por PCR

• Detetar e medir o RNA numa amostra, convertendo-o em cDNA e amplificando-o por PCR.

• Detetar e medir RNA numa amostra, convertendo-o em DNA e amplificando-o por PCR

• Detetar e medir proteínas numa amostra, convertendo-as em DNA e amplificando-as por PCR.

Que fatores devem ser considerados no desenho de primers para RT-PCR?

• Concentração alvo, comprimento alvo, especificidade alvo, temperatura de melting (Tm) do alvo, %GC do alvo, estruturas secundárias do alvo, formação de dímero-alvo

• concentração do template, comprimento do template, especificidade do template, temperatura de melting (Tm) do template, %GC do template, estruturas secundárias do template, formação de dímero-template

• sequência de primers, concentração de primers, comprimento de primers, especificidade de primers, formação de dímeros de primers, temperatura de melting (Tm) de primers, %GC de primers

• especificidade do alvo, comprimento do primer, temperatura de melting (Tm), %GC, estruturas secundárias, formação de dímeros de primer, concentração de primer

Delta Ct é ...

• uma medida usada em PCR quantitativo (qPCR) para determinar os níveis relativos de expressão génica entre amostras

• uma medida usada em PCR quantitativo (qPCR) para determinar a concentração de DNA numa amostra

• uma medida usada em PCR qualitativo (qPCR) para determinar a presença ou ausência de um gene.

• uma medida usada em PCR quantitativo (qPCR) para determinar os níveis absolutos de expressão génica.

O Delta Ct é calculado ______________ o valor de Ct do gene alvo pelo valor de Ct do gene de referência.

Qual o significado da temperatura de melting (Tm) na curva de melting?

• A temperatura de melting (Tm) é uma medida da estabilidade da dupla hélice do DNA.

• A temperatura de melting (Tm) é uma medida do comprimento da sequência de DNA.

• A temperatura de melting (Tm) é uma medida da taxa de replicação do DNA.

• A temperatura de melting (Tm) é uma medida da concentração de DNA.

Quais destes fatores podem afetar os valores de Delta Ct?

• Quantidade de RNA inicial, temperatura da reação de transcrição reversa, tipo de gene de referência, calibração do instrumento qPCR

• Qualidade da amostra de RNA, eficiência da reação de transcrição reversa, escolha do gene de referência, precisão do instrumento qPCR

• Todos estes fatores influenciam Delta Ct

Um Delta Ct negativo significa ...

• o gene alvo não é expresso nem na amostra controlo nem na amostra experimental

• o gene alvo é expresso em níveis mais elevados na amostra experimental do que na amostra controlo

• o gene alvo é expresso em níveis mais reduzidos na amostra experimental do que na amostra controlo

• houve um erro na escolha dos primers

O valor de Ct é calculado...

• medindo a quantidade de RNA na amostra

• analisando o tamanho do produto de PCR

• contando o número de moléculas de DNA na amostra

• determinando o número de ciclos de PCR necessários para que o sinal de fluorescência ultrapasse um limite pré-determinado