Vetores - Dia 3(10/09)

Durante um ciclo típico de PCR, qual é a função da etapa de anelamento, que geralmente ocorre entre 50-65°C?

• A separação da dupla hélice do DNA molde em fitas simples.

• A síntese de novas fitas de DNA pela polimerase termostável.

• A ligação dos primers oligonucleotídicos às suas sequências complementares no DNA molde.

• A ativação inicial da polimerase hot-start.

Ao clonar um gene para expressar uma proteína funcional, por que é preferível usar uma polimerase de alta fidelidade como a Pfu em vez da Taq polimerase padrão?

• A Pfu é significativamente mais rápida que a Taq, completando a PCR em menos tempo.

• A Pfu adiciona uma cauda de adenina (overhang A) na extremidade 3', o que facilita a clonagem em vetores TA.

• A Pfu possui atividade de revisão (proofreading 3'→5'), o que reduz drasticamente a taxa de erros e a chance de introduzir mutações indesejadas no gene.

• A Pfu funciona melhor em temperaturas de anelamento mais baixas, aumentando a especificidade.

Ao projetar um par de primers (forward e reverse) para uma PCR, qual é uma das "regras de ouro" em relação à sua temperatura de melting (Tm)?

• O Tm do primer forward deve ser pelo menos 10°C mais alto que o do primer reverse.

• Ambos os primers devem ter o Tm mais baixo possível, idealmente abaixo de 40°C.

• Os Tms de ambos os primers devem ser compatíveis, com uma diferença idealmente não superior a 1-4°C entre eles.

• O Tm não é um parâmetro importante, desde que o conteúdo de GC seja de 40-60%.

Na estratégia de clonagem por restrição, por que é necessário adicionar uma sequência "clamp" de 3-6 nucleotídeos na extremidade 5' do primer, antes do sítio de restrição?

• Para aumentar o Tm do primer e garantir um anelamento mais estável.

• Para aumentar o Tm do primer e garantir um anelamento mais estável.

• Porque a maioria das enzimas de restrição precisa de nucleotídeos extras adjacentes ao seu sítio para cortar eficientemente o DNA terminal.

• Para criar uma região de homologia para métodos como o Gibson Assembly.

Antes de sintetizar um par de primers, é crucial realizar uma validação in silico. Qual ferramenta é mais indicada para verificar se os primers podem se ligar a locais indesejados em um genoma complexo?

• OligoAnalyzer, que calcula o Tm e prediz a formação de dímeros e hairpins.

• SnapGene ou Benchling, que permitem simular a clonagem virtualmente.

• Primer-BLAST (do NCBI), que verifica a especificidade dos primers contra um banco de dados genômico.

• OligoCalc, que fornece o peso molecular e o conteúdo GC dos primers.

Se o objetivo é adicionar uma tag de hexahistidina (His6) na extremidade C-terminal de uma proteína via PCR, o que deve ser incluído na cauda 5' do primer reverse?

• Apenas um códon de parada (STOP) para finalizar a tradução corretamente.

• A sequência de nucleotídeos que codifica os seis resíduos de histidina, seguida por um códon de parada, e antes do sítio de restrição (se houver).

• A sequência de reconhecimento da DNA polimerase.

• Uma sequência de 40 nucleotídeos homóloga ao vetor para recombinação in vivo.