09 Reaksi PCR dan thermal cycler

Seorang mahasiswa D3 TLM sedang melakukan uji PCR untuk mendeteksi gen penyebab tuberkulosis dari sampel dahak pasien. Ia telah menambahkan semua komponen reaksi seperti primer, buffer, MgCl₂, Taq DNA polymerase, dan dNTP. Namun, hasil amplifikasi menunjukkan pita yang sangat lemah setelah elektroforesis. Langkah pertama yang sebaiknya dilakukan dalam optimasi reaksi adalah memeriksa:

• Konsentrasi primer

• Volume total reaksi

• Jenis pipet yang digunakan

• Jumlah siklus PCR

• Suhu penyimpanan enzim

Seorang analis melakukan PCR untuk mengidentifikasi bakteri penyebab infeksi luka. Semua reagen telah ditambahkan, tetapi hasil elektroforesis tidak menunjukkan adanya pita DNA. Setelah evaluasi, diketahui bahwa konsentrasi MgCl₂ yang digunakan jauh lebih rendah dari standar. Kondisi ini paling mungkin menyebabkan:

• Denaturasi DNA yang tidak sempurna

• Aktivitas Taq polymerase tidak optimal

• Primer terdegradasi oleh nuklease

• Konsentrasi dNTP berlebihan

• Jumlah siklus terlalu sedikit

Dalam penelitian skrining genetik, mahasiswa merancang program PCR dengan tahapan: denaturasi 94°C selama 30 detik, annealing 45°C selama 30 detik, dan ekstensi 72°C selama 1 menit. Namun, hasil elektroforesis menunjukkan banyak pita non-spesifik. Perbaikan yang paling tepat untuk meningkatkan spesifisitas adalah:

• Menurunkan jumlah siklus

• Meningkatkan suhu annealing

• Memperpendek waktu ekstensi

• Menambah volume template

• Mengurangi konsentrasi primer

Seorang teknisi laboratorium melakukan PCR deteksi virus dengan konsentrasi primer yang lebih tinggi dari rekomendasi protokol. Setelah proses selesai, hasil menunjukkan pita DNA non-spesifik dan smear pada gel. Penyebab paling mungkin fenomena ini adalah:

• Jumlah dNTP terlalu rendah

• Primer mengalami mispairing dengan DNA non-target

• Konsentrasi MgCl₂ terlalu tinggi

• Suhu annealing terlalu tinggi

• Volume template terlalu kecil

Dalam pemeriksaan molekuler infeksi saluran pernapasan, seorang analis yakin bahwa semua komponen PCR sudah benar tetapi hasil tetap negatif. Ia mencurigai adanya kerusakan pada termal sikler. Fungsi utama alat ini dalam reaksi PCR adalah:

• Mendeteksi hasil amplifikasi

• Mengatur perubahan suhu secara siklik sesuai tahapan PCR

• Menyimpan hasil DNA

• Menambahkan enzim ke dalam reaksi

• Menyaring DNA kontaminan

Saat mengoptimasi reaksi PCR untuk mendeteksi gen resistansi antibiotik, seorang mahasiswa menambahkan konsentrasi MgCl₂ lebih tinggi dari rekomendasi. Hasil amplifikasi menunjukkan munculnya pita DNA tambahan yang tidak diharapkan. Fenomena ini kemungkinan disebabkan oleh:

• Aktivitas Taq polymerase yang terlalu tinggi

• dNTP menjadi tidak stabil

• Primer mengalami degradasi

• Denaturasi tidak sempurna

• Template tidak terikat

Dalam sebuah penelitian genetik, mahasiswa merancang primer untuk PCR deteksi mutasi gen. Hasilnya gagal menunjukkan amplifikasi yang baik, dan diketahui bahwa suhu annealing terlalu rendah dibandingkan titik leleh primer. Keberhasilan tahap annealing sangat bergantung pada:

• Panjang DNA target

• Konsentrasi MgCl₂

• Suhu yang sesuai dengan titik leleh primer

• Jumlah siklus PCR

• Volume reaksi total

Seorang analis melakukan PCR untuk mengidentifikasi virus dengue tetapi lupa menambahkan dNTP ke dalam campuran reaksi. Setelah amplifikasi, hasil elektroforesis tidak menunjukkan pita DNA. Hal ini terjadi karena:

• Primer tidak berikatan

• Tidak ada bahan dasar untuk sintesis DNA baru

• Enzim menjadi inaktif

• Denaturasi tidak terjadi

• Suhu terlalu rendah

fikasi gen housekeeping, tahap ekstensi biasanya dilakukan pada suhu 72°C. Pemilihan suhu ini didasarkan pada alasan bahwa:

• Suhu tersebut adalah suhu optimum aktivitas Taq polymerase

• Suhu ini mempercepat denaturasi DNA

• Suhu ini memastikan primer tidak terlepas

• Suhu ini menurunkan aktivitas dNTP

• Suhu ini meningkatkan stabilitas template

Seorang mahasiswa mendapati hasil PCR yang tidak spesifik meskipun semua suhu telah disesuaikan dengan protokol. Setelah analisis lebih lanjut, ia menemukan bahwa primer yang dirancang memiliki homologi tinggi dengan sekuens non-target. Kesalahan dalam desain primer dapat menyebabkan:

• Tidak adanya amplifikasi

• Ikatan ke lokasi non-target

• Peningkatan konsentrasi dNTP

• Denaturasi tidak lengkap

• Penurunan aktivitas enzim