Cuantificación del ADN

Cuantificación de ácidos nucleicos

Espectrofotometría

Objetivos de aprendizaje:

• Entender los principios básicos de la espectrofotometría.

• Conocer el fundamento detrás de la cuantificación de ADN a partir de la absorción de luz ultravioleta (UV).

• Interpretar los valores obtenidos para determinar la pureza y concentración del ADN.

Explica cómo el ADN absorbe luz en la región ultravioleta, particularmente a 260 nm, debido a los anillos aromáticos de las bases nitrogenadas.

Fundamento

La espectrofotometría es una técnica que mide la cantidad de luz absorbida por una muestra. Cada molécula absorbe luz a una longitud de onda específica.

Definición

Introducción a la espectrofotometría

Ley de Lambert-Beer

Donde:

• A es la absorbancia

• ε es el coeficiente de extinción molar*

• c es la concentración

• l es la longitud del camino óptico (generalmente 1 cm)

​Muestra cómo a partir de la absorbancia, se puede calcular la concentración de ADN en la muestra.

*​ El coeficiente de extinción molar (también llamado coeficiente de absorción molar) es una constante que describe cuán eficientemente una molécula absorbe luz a una longitud de onda específica. En términos más simples, mide la capacidad de una sustancia para absorber luz en función de su concentración.

Espectrofotometría aplicada al ADN

​Absorción del ADN a 260 nm:

Espectrofotometría aplicada al ADN

Pureza del ADN

Limitaciones y consideraciones

• ARN y contaminantes: El ARN también absorbe a 260 nm, por lo que podría afectar los resultados si no se eliminan completamente.

• Sustancias contaminantes: la presencia de contaminantes como fenol, sales o detergentes pueden interferir con las lecturas espectrofotométricas, reduciendo la precisión de la cuantificación.

• Alternativas para la cuantificación de ADN: Compara la espectrofotometría con otras técnicas como el uso de fluorometría (que usa tintes que se intercalan en el ADN para medir su concentración).

Multiple Choice

¿A qué longitud de onda máxima absorbe el ADN en un espectrofotómetro?

• 300 nm
• 280 nm
• 240 nm
• 260 nm

Multiple Choice

¿Qué valor de absorbancia a 260 nm corresponde a 1 μg/mL de ADN bicatenario?

• 0.100
• 0.050
• 0.020
• 0.010

Multiple Choice

¿Cuál es la relación A₂₆₀​/A₂₈₀​ que indica ADN puro?

• 1.5
• 3.0

• 1.2
• 1.8

Multiple Choice

Si una muestra de ADN tiene una relación A₂₆₀​/A₂₈₀​ menor a 1.8, ¿qué podría indicar?

• Que el ADN es de alta pureza.

• Contaminación con ARN

• Contaminación con proteínas

• Que la muestra contiene sales

Multiple Choice

¿Qué factor se utiliza para convertir la absorbancia a 260 nm en la concentración de ADN de doble cadena en μg/mL?

• 25 μg/mL por unidad de absorbancia (A260)
• 100 μg/mL por unidad de absorbancia (A260)
• 10 μg/mL por unidad de absorbancia (A260)
• 50 μg/mL por unidad de absorbancia (A260)

Multiple Choice

¿Qué sugiere una relación A260​/A280​ mayor a 2.0 en una muestra de ADN?

• Contaminación con proteínas

• Presencia de fenol

• Alta concentración de sales

• Contaminación con ARN

Multiple Choice

¿Qué indica un valor de absorbancia mayor a 1.0 a 260 nm?

• Indica alta concentración de ácidos nucleicos.
• Indica que la muestra está contaminada.
• Indica presencia de proteínas en la muestra.
• Indica baja concentración de ácidos nucleicos.

Multiple Choice

¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre la cuantificación de ADN es incorrecta?

• La relación A260/A280 es un indicador de pureza del ADN

• Las proteínas contaminantes absorben luz a 280 nm

• El coeficiente de extinción molar del ADN de doble cadena es 50 μg/mL

• El ARN no afecta las lecturas a 260 nm

Multiple Choice

¿Qué es la Espectrofotometría?

• Técnica espectroscópica para tasar la concentración o la cantidad de especies determinadas.

• Estudio de la interacción de la materia con la fotometría.

• Estudio de los colores en la interacción química.

• Ninguna de las anteriores.

Multiple Choice

La espectrofotometría entre qué rangos trabaja:

• Entre 200 a 800 nm de longitud de onda, o sea espectro

  electromagnético entre uv y luz visible.

• Entre 100 a 1800 nm de longitud de onda, o sea espectro

  electromagnético entre uv y luz visible.

• Entre 20 a 80 nm de longitud de onda, o sea espectro

  electromagnético entre uv y luz visible.

• Ninguna de las anteriores.

Dropdown

La ley de Lambert-Beer establece que la cantidad de luz

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por una muestra es directamente proporcional a la​

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del analito presente y a la longitud de la trayectoria de la luz a través de la muestra