Clase 3.1 Preparación de proteínas para análisis y aplicaciones

​Preparación de proteínas para análisis y aplicaciones

​Preparación de proteínas para análisis y aplicaciones

1. Investigación biológica: para desarrollar reactivos como enzimas y anticuerpos que se pueden utilizar como herramientas de biología molecular para comprender los procesos celulares.

2. Diagnóstico: las proteínas purificadas se utilizan para desarrollar ensayos y pruebas para detectar enfermedades.

3. Monitoreo ambiental: se utilizan biosensores basados en proteínas para detectar contaminantes.

4. Alimentos y cosméticos: el contenido de proteínas en productos alimenticios y cosméticos debe cumplir con ciertos estándares de seguridad debido al riesgo de reacciones alérgicas.

5. Ciencia forense: se utilizan proteínas para identificar sustancias en investigaciones criminales.

6. Desarrollo biofarmacéutico: las proteínas purificadas son fundamentales para el desarrollo y la producción de medicamentos, incluidas proteínas terapéuticas y vacunas.

Fraccionamiento con sulfato de amonio

La solubilidad de las proteínas primero aumenta con bajas concentraciones de sal (salting-in), pero disminuye con altas concentraciones, lo que puede llevar a su precipitación (salting-out).

Fraccionamiento con sulfato de amonio

El salting-out, especialmente con sulfato de amonio, es una técnica útil para purificar proteínas debido a sus diferentes solubilidades; se realiza a baja temperatura para mantener la estabilidad, y la proteína precipitada se recupera por centrifugación.

​Tratamiento térmico

La purificación de proteínas se realiza a baja temperatura para preservar su estabilidad, ya que muchas se desnaturalizan y precipitan por encima de los 40 °C. Las diferencias en sensibilidad al calor pueden aprovecharse para purificarlas, inactivando proteínas menos estables mediante incubación controlada y eliminándolas por centrifugación.

​Filtración en gel

La cromatografía de exclusión molecular (o filtración en gel) separa moléculas según su tamaño y forma usando una matriz porosa. Las moléculas grandes, que no entran en los poros, eluyen primero; las más pequeñas, que penetran en los poros y recorren un camino más largo, eluyen después.

Labelling

Señala el peso molecular de las proteínas según su orden de elución en esta filtración en gel:

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Alto

Bajo

Medio

Filtración en gel

Existen diversas matrices comerciales para cromatografía de exclusión molecular, como Sephadex (dextrano), Sepharose (agarosa) y Bio-Gel (poliacrilamida), que varían en porosidad y permiten separar proteínas de diferentes tamaños. Los geles más porosos, como los de agarosa y Sephacryl, pueden fraccionar macromoléculas de hasta varios millones de daltones. La rigidez y estabilidad de algunas matrices se mejora combinando materiales, como en los geles de poliacrilamida con agarosa (Ultrogel).

Match

Une las siguientes matrices comerciales con el compuesto que las compone:

• Sephadex

• Sepharosa

• Bio-Gel P

• Poliacrilamida + agarosa

Dextrano

Agarosa

Poliacrilamida

Ultrogel

• Dextrano

• Agarosa

• Poliacrilamida

• Ultrogel

​En la cromatografía de exclusión molecular, las perlas de gel se colocan en una columna y se equilibran con tampón.

La mezcla de proteínas se aplica en la parte superior, y las fracciones se recolectan a medida que eluden.

Las proteínas se separan según su capacidad para entrar en los poros del gel: las más grandes no entran y salen primero, distribuyéndose en el llamado volumen de exclusión.

​Las proteínas pequeñas entran en los poros del gel y se eluyen lentamente, mientras que las grandes, que no entran, salen primero. Las de tamaño intermedio se distribuyen parcialmente entre los poros y se separan según su peso molecular, eluyéndose en orden desde las más grandes hasta las más pequeñas.

Para un fraccionamiento eficaz, es crucial elegir un gel con poros adecuados: si la proteína es demasiado grande o demasiado pequeña para los poros, no se separará bien de otras proteínas. La mejor resolución se logra cuando la proteína de interés es parcialmente excluida, permitiendo una separación más precisa según el peso molecular.

Kav = (volumen de elución - volumen muerto)
(volumen total de la matriz empacada - volumen muerto)

​Una columna de filtración en gel puede calibrarse con proteínas de peso molecular conocido para estimar el peso de proteínas desconocidas según su volumen de elución.

Sin embargo, la forma de la proteína influye en su comportamiento, por lo que la precisión depende de la similitud entre la proteína analizada y los estándares usados.

​Cromatografía de intercambio iónico

Las resinas de intercambio iónico son matrices con grupos cargados que se unen a iones de carga opuesta. Las resinas catiónicas (carga negativa) intercambian cationes, y las aniónicas (carga positiva) intercambian aniones. Este principio permite separar moléculas según su carga.

A: Resina de intercambio catiónico con contraiones positivos unidos

B: Resina de intercambio aniónico con contraiones negativos unidos

​Las resinas más comunes en cromatografía de intercambio iónico de proteínas son la CM-celulosa y la DEAE-celulosa, derivadas de celulosa modificada.

La CM-celulosa contiene grupos carboximetilo (-CH₂OCH₂COOH), que se ionizan a pH neutro como -CH₂OCH₂COO⁻, otorgándole carga negativa y función como intercambiador catiónico.

En cambio, la DEAE-celulosa contiene grupos dietilaminoetilo con una amina terciaria (-CH₂CH₂N⁺(C₂H₅)₂) que se protona a pH neutro, adquiriendo carga positiva y actuando como intercambiador aniónico.

La carga de una proteína depende del tipo y cantidad de aminoácidos con grupos ionizables, como lisina (positiva) o ácido glutámico (negativa).

Cada uno de estos grupos tiene un valor de pKa, que es el pH al cual el grupo está 50 % ionizado.

Debido a que cada proteína tiene una composición única de aminoácidos, adquiere diferentes cargas según el pH del medio, lo que permite su separación basada en la carga.

El punto isoeléctrico (pI) de una proteína es el pH en el que su carga neta es cero.

A este pH no se une a resinas de intercambio iónico.

Por debajo del pI, la proteína tiene carga positiva y se une a resinas catiónicas; por encima, tiene carga negativa y se une a resinas aniónicas.

La elección del intercambiador depende del pH en el que la proteína sea más estable.

Multiple Choice

El punto isoeléctrico (pI) de una proteína es el pH al cual tiene una carga neta cero.

• Verdadero

• Falso

Para lograr una buena unión en intercambio iónico, el pH del tampón debe estar al menos una unidad por encima o por debajo del pI de la proteína.

El rango efectivo de pH para usar DEAE-celulosa y CM-celulosa es entre 5 y 9.

Además, se requiere una fuerza iónica baja, ya que una fuerza iónica alta reduce la afinidad de unión, lo cual puede aprovecharse para eluir proteínas.

Multiple Choice

Estás purificando una proteína que tiene un punto isoeléctrico (pI) de 6.5. Si la proteína es más estable a pH 5.5, ¿qué estrategia de intercambio iónico sería más adecuada?

• Intercambiador aniónico a pH 7.5


• Intercambiador catiónico a pH 5.5


• Intercambiador catiónico a pH 7.5


• Intercambiador aniónico a pH 5.5

Las proteínas con carga opuesta a la de la resina se unirán desplazando contraiones, mientras que las de carga igual o neutra no se unirán y pasarán directo.

La afinidad de unión puede modificarse ajustando el pH o la fuerza iónica: al disminuir el pH, las proteínas pierden carga negativa, reduciendo su afinidad por la resina y permitiendo su elución a distintos pH según su composición.

Las proteínas unidas a una columna de intercambio iónico pueden eluirse gradualmente bajando el pH o aumentando la fuerza iónica del tampón.

Un gradiente de pH permite separar proteínas según el valor al que pierden su afinidad por la resina.

Alternativamente, un gradiente de NaCl eleva la competencia iónica, desplazando las proteínas unidas sin cambiar el pH.

Multiple Choice

Una proteína se eluye de una columna de intercambio aniónico cuando se incrementa la concentración de NaCl. ¿Qué conclusión puedes sacar?

• La proteína tiene una carga neta positiva

• La proteína tiene una alta hidrofobicidad

• La proteína tiene una carga neta negativa

• La proteína interactúa con un ligando específico

Multiple Choice

El uso de gradientes de sal en cromatografía de intercambio iónico permite separar proteínas con diferentes cargas netas.


• Verdadero

• Falso

Cromatografía de interacción hidrofóbica

La cromatografía de interacción hidrofóbica separa proteínas según su afinidad por matrices hidrofóbicas, usando alta concentración de sal para promover la unión.

La elución se logra disminuyendo gradualmente la sal o aplicando agentes como etilenglicol, etanol o urea para liberar proteínas fuertemente unidas.

Multiple Choice

Durante una cromatografía de interacción hidrofóbica, una proteína no se une a la matriz. ¿Qué ajuste sería el más probable para mejorar su retención?

• Aumentar la concentración de sal en el tampón

• Disminuir el pH

• Añadir urea

• Cambiar a una columna de afinidad

Multiple Choice

La cromatografía de interacción hidrofóbica requiere tampón con baja concentración de sal para favorecer la unión.

• Verdadero

• Falso

Es una técnica altamente específica para purificar proteínas, utilizando matrices como agarosa (Sepharose), poliacrilamida (BioGel P) o dextrano entrecruzado (Sephacryl) a las que se ha unido covalentemente un ligando. El ligando se selecciona según la afinidad biológica de la proteína de interés. Por ejemplo, para purificar una enzima, se puede usar un sustrato, un inhibidor o un activador reversible. Algunos ejemplos comunes incluyen:

• Glutatión unido a agarosa para purificar proteínas de fusión con GST.

• Ni²⁺-NTA agarosa para proteínas con etiqueta His (His-tag).

• Anticuerpos inmovilizados para purificar antígenos específicos.

​Cromatografía de afinidad

En cromatografía de afinidad, la matriz se empaca con un tampón que favorece la unión específica proteína-ligando, incluyendo cofactores necesarios y alta fuerza iónica para evitar uniones no específicas.

Tras aplicar y lavar la muestra, la proteína deseada se eluye selectivamente usando un sustrato, inhibidor, o ajustando el pH o la fuerza iónica.

Multiple Choice

A mayor fuerza iónica, mayor afinidad de la proteína por la resina en intercambio iónico.


• Verdadero

• Falso

Multiple Choice

Una proteína que se une a una columna de afinidad no se eluye con un tampón de alta fuerza iónica. ¿Qué cambio sería más eficaz para lograr su elución sin desnaturalizarla?

• Aumentar la temperatura de la columna

• Disminuir la concentración de sustrato

• Cambiar el pH para alterar la interacción proteína-ligando

• Lavar con etanol

La cromatografía de afinidad es una de las técnicas más eficaces para purificar una proteína específica en un solo paso.


Sin embargo, su aplicación requiere conocer la función de la proteína y contar con un ligando o anticuerpo específico, lo que limita su uso en muchos casos.

Multiple Choice

La cromatografía de afinidad es útil incluso si no se conoce la función de la proteína

• Verdadero

• Falso

Multiple Choice

Tienes una mezcla de proteínas y deseas separarlas y purificarlas en función de su tamaño sin necesidad de que interactúen con la matriz. ¿Qué técnica usarías?

• Cromatografía de afinidad


• Cromatografía de exclusión por tamaño (filtración en gel)

• Cromatografía de intercambio iónico

• Electroforesis en gel


¿Quieres aprender más?

Purificación de proteínas: técnicas y protocolos explicados
Una introducción detallada a los métodos de purificación de proteínas.
https://www.technologynetworks.com/proteomics/articles/protein-purification-techniques-and-protocols-explained-367037

Una introducción a los métodos de purificación de proteínas
Guía completa sobre métodos de purificación de proteínas.
https://www.promega.com/resources/guides/protein-purification/introduction-to-protein-purification/

Métodos de purificación de proteínas
Resumen de métodos de purificación de proteínas utilizados en ciencias clínicas.
https://www.uvm.edu/~dahammon/biol3810/lecture4.pdf

Resumen de la purificación por afinidad
Descripción general de la cromatografía de afinidad.
https://www.thermofisher.com/ec/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/affinity-purification.html