ENCIMI2

Nove encime (celulaze) lahko pridobimo tako da:

• Ekstrahiramo celokupne proteine iz izbranih okoljskih vzorcev

• izoliramo nove mikrobne seve, jih namnožimo in izoliramo tarčne encime s kromatografskimi metodami

• izoliramo nove mikrobne seve, iz njih izoliramo DNA in tarčne gene nato vnesemo in izrazimo v heterolognih gostiteljih

• izoliramo DNA mikrobne združbe neposredno iz okolja bogatega s celulozo, in jo nato analiziramo / izrazimo v heterolognem gostitelju

Kaj so mikrobne celične tovarne?

• Naravni mikrobni izolati, katerih končni produkt fermentacije je etanol.

• Encimski kompleksi, ki omogočajo pretvorbo substratov v produkte z dodano vrednostjo.

• Mikrobni sevi z optimiziranim metabolizmom, ki omogoča ućinkovitejšo pretvorbo substratov v produkte z dodano vrednostjo.

Metagenom:

• Je celokupna DNA mikrobne združbe v nekem okoljskem vzorcu.

• Predstavlja bogat vir zapisov za (nove) encime mikroorganizmov, ki jih (še) ne znamo gojiti.

• lahko uporabimo kot vir sekvenc za iskanje zapisov za encime s strukturno podobnostjo že obstoječim.

• lahko uporabimo kot vir sekvenc za heterologno izražanje in detekcijo novih encimov na osnovi njihove aktivnosti.

Za hitro detekcijo (hemi)celulolitične aktivnosti (nativnih celulolitičnih izolatov ali heterologno proizvedenih encimov) lahko uporabimo:

• 2D PAGE

• afinitetno kromatografijo

• Agarozne plošče z vklopljenim substratom (CMC, ksilan) in naknadno barvanje s Kongo rdečim

• gelsko filtracijo

Kakšne so prednosti optimizacije metabolizma mikrobnih sevov z UV mutagenezo:

• Je enostavna in poceni

• Mutacije lahko vnesemo v točno določene gene

• Sevi niso GMO

• Potrebno je obsežno presejalno testiranje

Pri naključni mutagenezi:

• Seve lahko spreminjamo z izpostavitvijo UV ali ionizirajočim EM valovanjem.

• Je potrebno obsežno presejalno testiranje mutant.

• V seve lahko vnašamo mutacije z analogi org. dušikovih baz, interkalirajočimi spojinami, dušikovo kislino.

• nastanejo genetsko modificirani sevi

Na kakšne načine lahko pripravimo mikrobne celične tovarne, ki bodo rastlinske odpadke učinkovito pretvorile v bioetanol?

• S prenosom celulaznih genov iz nativno celulolitičnih sevov v solventogene industrijske seve.

• Spreminjanjem metabolnih poti nativnih celulolitičnih sevov, ki sladkorje fermentirajo do etanola.

• S pripravo kokteilov bakterijskih sevov za optimalno razgradnjo substrata.

• Z kofermentacijo solventogenih in celulolitičnih sevov.

Kako lahko optimiziramo proizvodnjo heterolognih encimov v rekombinantnih industrijskih sevih na ravni translacije?

• Z izborom ustrezne kombinacije donorja tarčnega gena in ekspresijskega seva (sorodnost)

• S prilagojenim gostiteljem (vnos zapisov za redke tRNA).

• S prilagoditvijo kodonov vstavljenega gena gostitelju.

• S spreminjanjem vrednosti pH gojišča.

Na kakšne načine lahko vplivamo na ustrezno zvijanje heterologno izraženih proteinov?

• Z inkubacijo pri nižjih temperaturah

• Z dodajanjem ustreznega signalnega peptida za iznos iz gostiteljskih celic

• Z izborom prilagojenega eksperijskega seva (delecije tioredoksina/glutation reduktaze ali koekspresijo šaperonov)

• Z uporabo sevov brez proteaz.

Lastnosti encimov (kot sta katalitična učinkovitost in stabilnost) lahko izboljšamo:

• Z zamenjavo signalnega peptida na izvornem genu.

• Z racionalnim pristopom, pri katerem uporabljamo algoritem za napoved želenih sprememb v strukturi tarčnega proteina.

• Z naključnim zaporednim uvajanjem sprememb v tarčne gene z epPCR v kombinaciji z obsežnim presejalnim testiranjem lastnosti.

• Z zaporednim izpostavljanjem tarčnega proteina naraščajočemu selekcijskemu pritisku.