11 Deteksi SARS-CoV-2

Seorang petugas laboratorium menerima sampel swab nasofaring dari pasien dengan gejala demam dan batuk selama 5 hari. Untuk mendeteksi keberadaan SARS-CoV-2, ia melakukan pemeriksaan yang diawali dengan konversi RNA menjadi cDNA sebelum amplifikasi. Tahap ini disebut

• Denaturasi

• Reverse Transcription

• Elusi RNA

• Annealing

Seorang mahasiswa TLM sedang mempelajari metode RT-PCR untuk deteksi SARS-CoV-2. Ia mengetahui bahwa virus ini memiliki materi genetik berupa RNA untai tunggal, sehingga diperlukan enzim khusus untuk membentuk cDNA sebelum PCR. Enzim yang dimaksud adalah

• DNA polimerase

• Ligase

• Reverse transcriptase

• RNA polimerase

Dalam proses RT-PCR, probe TaqMan digunakan untuk mendeteksi amplifikasi. Probe ini membawa fluorofor dan quencher yang akan terpisah saat enzim bekerja. Tahap enzimatik yang menyebabkan pemotongan probe adalah

• Reverse transcription

• Annealing primer

• 5’ nuclease activity saat extension

• Denaturasi DNA

Seorang teknisi melakukan RT-PCR untuk sampel pasien. Mesin PCR menunjukkan kurva fluoresensi yang meningkat dan melampaui ambang pada siklus ke-28. Hal ini mengindikasikan bahwa

• Sampel negatif SARS-CoV-2

• Sampel tidak valid

• Viral load sangat rendah

• RNA virus SARS-CoV-2 terdeteksi dengan jumlah cukup

Dalam tahap ekstraksi RNA, sampel yang telah dilisis ditambahkan ke kolom silika dan disentrifugasi untuk mengikat RNA. Prinsip pengikatan RNA pada membran silika adalah

• Interaksi hidrofobik pada suhu tinggi

• Adsorpsi dalam kondisi garam dan pH optimal

• Reaksi enzimatik antara RNA dan silika

• Ikatan kovalen permanen

Seorang analis laboratorium sedang menyiapkan reaksi RT-PCR menggunakan metode one-step. Ia mencampurkan semua komponen reaksi, termasuk enzim RT dan DNA polimerase dalam satu tabung. Tujuan metode ini adalah

• Menghemat jumlah RNA template

• Memisahkan proses RT dan PCR secara manual

• Mempercepat dan menyederhanakan proses deteksi

• Menghindari penggunaan primer

Sebelum proses amplifikasi, mahasiswa diminta menambahkan elution buffer ke kolom silika untuk memperoleh RNA murni. Fungsi elution buffer pada tahap ini adalah

• Menyediakan garam tinggi untuk mengikat RNA

• Melarutkan RNA yang terikat agar terlepas ke tabung bawah

• Mengendapkan protein pengotor

• Mengaktifkan enzim polimerase

Mesin Real-Time PCR mencatat sinyal fluoresensi pada setiap siklus untuk membentuk kurva amplifikasi. Kurva ini digunakan untuk menentukan nilai Ct. Nilai Ct merupakan

• Jumlah total siklus yang dilakukan

• Siklus di mana sinyal fluoresensi melampaui ambang batas

• Konsentrasi akhir DNA target

• Suhu optimal annealing

Dalam pemeriksaan RT-PCR, digunakan kontrol positif yang berisi RNA transkrip gen target. Kontrol ini berfungsi untuk

• Menunjukkan bahwa tidak ada kontaminasi

• Mengukur konsentrasi primer

• Memastikan reagen dan sistem PCR berfungsi dengan benar

• Menentukan suhu optimal annealing

Seorang mahasiswa menemukan bahwa kontrol negatif pada hasil RT-PCR menunjukkan sinyal fluoresensi yang melewati threshold. Hal ini mengindikasikan bahwa

• Reaksi berlangsung dengan baik

• Terjadi kontaminasi pada kontrol negatif

• Primer terlalu banyak digunakan

• RNA target terlalu sedikit