Clase 1.2 Microscopía aplicada

Ver para creer:

Microscopía aplicada

Biología Molecular II
PhD. Caroline Bacquet

Rangos de observación

Rangos de observación

Rangos de observación

Mecanismos de generación de imagen

Tipos de microscopios

(Tae & Jae, 2012)

Un embrión de pollito fue
modificado genéticamente para
volverlo fluorescente.

Las células marcadas
expresando GFP (proteína verde
fluorescente) pudieron observarse
en el microscopio y monitorear
su tasa de expresión.

La microscopía en el laboratorio

Multiple Select

¿ Qué miscroscopio(s) permite(n) observar los objetos en 3 dimensiones ? Marca todas las correctas

• Electrónico de barrido

• Epifluorescencia

• Confocal

• Fuerza atómica

Multiple Choice

¿ Qué microscopio electrónico se utiliza para observar la estructura interna de la célula?

• Microscopio de fuerza atómica

• Microscopio electrónico de transmisión

  
  

• Microscopio electrónico de barrido

• Microscopio de contraste de fases

Multiple Choice

¿Quién añadió la iluminación a la muestra del microscopio?

• Carl Zeiss

• Robert Hooke

• Anton van Leeuwenhoek

• Max Knoll

Multiple Choice

¿Qué nombre les dió Robert Hooke a ciertas celdillas que observó en una muestra de corcho?

• Neuronas

• Mitocondrias

• Células

• Virus

Multiple Choice

¿Quién descubrió los protozoos y espermatozoides gracias al microscopio?

• Cornelius Drebbel

• Galileo Galilei

• Anton van Leuwenhoek

• Marvin Minsky

Multiple Choice

¿Qué se observa con el microscopio de contraste de fases?

• Atomos

• Células vivas en cultivo

• Capilares sanguíneos

• Retículo endoplasmático

Microscopio de campo oscuro y contraste de fases

Campo oscuro es una técnica tradicional de
contraste. Se utiliza para observar los
contornos de diferentes tejidos y células.

Contraste de fase es utilizado
principalmente para observar células que no
han sido tinturadas. Las fases varían
respecto a la cantidad de objetivos
especializados presentes en el microscopio.

​Se muestran cuatro imágenes de la misma célula fibroblástica en cultivo. Todas las imágenes de pueden obtenerse con la mayoría de los microscopios modernos intercambiando componentes ópticos. (A) Microscopía de campo claro, en la que la luz se transmite directamente directamente a través de la muestra. (B) Microscopía de contraste de fase donde la luz transmitida a través de la muestra se traducen en cambios de brillo. (C) Microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) que resalta los bordes en los que de refracción. (D) Microscopía de campo oscuro, en la que la muestra se ilumina lateralmente y sólo se ve la la luz dispersa.

Multiple Choice

¿Qué sustancia/tejido se tiñe de rojo con el Oil Red O?

• Neuronas

• Cuerpos lipídicos

• ADN

• Calcio

Multiple Choice

¿Qué tiñe la hematoxilina?

• Citoplasma

• Mucinas

• Núcleos

• Actina

Multiple Choice

Eosina es un tinte ácido

• Verdadero

• Falso

Microscopio de fluorescencia

Es la técnica de contraste más
utilizada.

Se hace uso de un marcador que es
excitado con un rango de onda de luz
específico, que permite observar
estructuras celulares deseadas.

El marcador se llama fluoróforo.
Algunos ejemplos son: FITC
(Fluoresceína), DAPI, GFP, YFP, etc.
Cada uno cuenta con un rango de
excitación y emisión.

Microscopio de fluorescencia

Fluoróforos: emisión y excitación

En las moléculas fluorescentes existe
una región molecular capaz de absorber
y emitir energía luminosa.

Esta región presenta un espectro propio
de absorción y emisión, expresado
normalmente en nanómetros.

Las curvas de excitación o absorbancia siempre son más elevadas que las de emisión (en

términos de energía de onda). Es por esto que la excitación se expresa con un pico cercano a los
495 nm (verde azulado), mientras que la de emisión, cercano a los 530 nm (verde amarillento).

El espectro corresponde al fluoróforo Alexa Fluor 488.

Multiple Choice

Una molécula fluorescente, al absorber un solo fotón de luz en una longitud de onda determinada, siempre lo emite a una longitud de onda más larga

• Verdadero

• Falso

Microscopio de fluorescencia

Proteínas reporteras fluorescentes

Microscopio confocal

Microscopio confocal

TIRF: Total Internal Reflection Fluorescence

TIRF es una gran herramienta para
monitorear procesos a tiempo real en
la membrana de células y otros
tejidos. Algunos de los procesos son
endo/exocitosis, dinámicas del
citoesqueleto, etc.

La luz incide en la zona conocida
como “campo evanescente”, que
normalmente no puede ser visibilizado
por los mecanismos de generación de
imagen fluorescente convencionales.

Confocal común vs TIRF

La figura confocal de campo amplio presenta una gran cantidad de ruido de
fondo, que no permite visibilizar de forma clara la presencia de actividad en
la membrana analizada. Por otro lado, TIRF produce una imagen de la zona

evanescente con gran facilidad.

Microscopía de superresolución

La microscopía óptica presenta un límite de
difracción, que causa que la visualización
de la imagen se vuelva borrosa al
aumentar la magnificación de la muestra.

Se han desarrollado mecanismos digitales
para mejorar la resolución a través de
algoritmos computacionales.

Microscopios electrónicos

Multiple Choice

¿Quiénes inventaron el microscopio electrónico?

• Ernest Rusk y Max Knoll

• Ernest Abbe y Carl Zeiss

• Galileo Galilei y Zacharias Janssen

• Robert Hooke y Galileo Galilei

Multiple Choice

¿Cuál es el máximo aumento que puede alcanzar un microscopio electrónico de trasmisión?

• 2.000.000x

• 5000x

• 1000x

• 400x

Multiple Choice

Medios de inclusión utilizados en el microscopio electrónico

• Resinas polimerizadas o Epoxi

• Parafina

• Gelatina

• Agar

TEM (Transmission electron microscopy)

Es uno de los primeros mecanismos de
microscopía electrónica desarrollado.

Se utiliza para generar imágenes
bidimensionales de alta resolución.

Tiene además una mayor capacidad
de magnificación que los
microscopios ópticos.

Utiliza un haz de electrones para
chocar con la muestra y generar la
imagen.

TEM (Transmission electron microscopy)

TEM (Transmission electron microscopy)

​Tomografía -electromicroscopía

SEM (Scanning electron microscopy)
Microscopía electrónica de barrido

En vez de la utilización de un haz de luz como en los microscopios ópticos, el microscopio electrónico de barrido (SEM) utiliza un haz de electrones.
Los electrones interactúan con la superficie de la muestra y genera imágenes tridimensionales.
La preparación de muestras requiere de una resina que la inmovilice y permita conducción electrónica.

SEM (Scanning electron microscopy)

​El microscopio electrónico de barrido produce imágenes de superficie con gran profundidad de campo. (A) Una flor de trigo en desarrollo, o espiga. Esta delicada espiga de flor fue congelada rápidamente, recubierta con una película delgada de metal y examinada en estado congelado con un SEM. Esta microfotografía de baja magnificación demuestra la gran profundidad de enfoque de un SEM, incluso con un espécimen grande como este. (B) Estos granos de polen de una flor de eléboro revelan sus paredes celulares esculpidas en el SEM. Las formas y patrones son específicos para cada especie de grano de polen. (C) Cadenas de bacterias que viven en las venas azules de un queso Stilton.

SEM (Scanning electron microscopy)

​Crio-electromicroscopía

Microscopio de fuerza atómica

No utiliza fuente de luz ni haz de
electrones. Usa un cantiléver de
punta de acero para interactuar
con la muestra, la cual debe ser
sólida.

Tiene un detector que es capaz de
medir las fallas topográficas de la
muestra y generar una imagen.

Multiple Choice

¿Qué se logra observar con el microscopio de fuerza atómica?

• Tela

• Insectos

• Cortes finos

• Moléculas

¡Gracias!