Clase 2.1 Análisis de ADN y ARN basados en secuencia

El gran libro de recetas:

Análisis de ADN y ARN por sus

secuencias nucleotídicas

Biología Molecular II
PhD. Caroline Bacquet

Estudios de secuencias

nucleotídicas

Desde que se adaptó la secuenciación de aminoácidos,

desarrollada por Frederick Sanger, y se enfocó en la secuenciación

de ácidos nucléicos, se ha descubierto que la combinación de

nucleótidos contiene la información clave detrás de la expresión

génica de cada individuo.

Aplicaciones: Vacuna SARS-CoV-2

Para fabricar la vacuna de ADN, se extrae el ARN monocatenario (ssRNA) de la
proteína spike del coronavirus SARS-CoV-2, se sintetiza en bicatenario (dsDNA) y
se clona en un plásmido. A continuación, este plásmido se inyecta por vía
intramuscular junto con un dispositivo de electroporación para facilitar la captación.

Recordemos cómo funciona la PCR

Es un método
ampliamente
utilizado para hacer
rápidamente de
millones a miles de
millones de copias
de una muestra de
ADN específica.

Fases de la PCR

Mediante la PCR, las
copias de cantidades
muy pequeñas de
secuencias de ADN
se amplifican
exponencialmente en
una serie de ciclos de
cambios de
temperatura.

Multiple Choice

¿Cuál es la diferencia principal entre PCR convencional y PCR en tiempo real?

• PCR tiempo real se usan sondas o moléculas que ayudan a detectar el producto de PCR

• PCR convencional se detecta y se amplifica al mismo tiempo

• PCR tiempo real no requiere el uso de buffer ni cloruro de magnesio.

• PCR convencional necesita un equipo que detecte el amplicón.

Multiple Choice

Durante un PCR los primers se pueden hibridar entre sí y formar bandas visibles de bajo tamaño, esas estructuras son...

• contaminación de ARN

• dímeros

• contaminación de proteínas

• fragmentación

Multiple Choice

Marca la opción correcta respecto el resultado de una PCR convencional

• No es necesario el uso de un transiluminador

• El resultado se debe leer en una electroforesis en gel junto con un cuantificador de medidas

• El control positivo me informa sobre una posible contaminación

• El control negativo me informa sobre la validación de la prueba (si es fiable el resultado o no)

Multiple Choice

Etapa de la PCR que se caracteriza por la acción exponencial de la polimerasa

• Desnaturalización

• Alineamiento

• Elongación

• Terminación

Multiple Choice

Nombre que recibe el producto final de la PCR

• MgCl

• dNTPs

• Amplicón

• Producto

Multiple Choice

Cofactor que requiere la Taq polimerasa para llevar a cabo su función

• dNTP's

• MgCl

• Primers

• No requiere ningún cofactor

Multiple Choice

Oligonucleótidos que identifican el gen o los genes que serán amplificados

• dNTP's

• Taq Polimerasa

• Primers

• MgCl

Secuenciación Illumina

Usaremos un ejemplo sencillo con 4 fragmentos de DNA para entender el mecanismo

Nucleótidos
fluorescentes

Los nucleótidos se incorporan mediante la acción de la Taq Polimerasa

Cámara de flujo

Se toma una imagen
de la cámara de flujo
desde arriba

El siguiente ciclo se registra la fluorescencia de los nuevos nucleótidos incorporados

Se toma una imagen
de la cámara de flujo
desde arriba

Cámara de flujo

El proceso se repite hasta que la Taq polimerasa ha amplificado todos los fragmentos

Cámara de flujo

Ahora las sondas se unen a la siguiente bases de cada fragmento

Para el análisis de
estos datos debemos
remover de las
secuencias los
adaptadores (paso 4)

PCR en tiempo real

Se hace uso de un
termociclador especial
que puede detectar la
fluorescencia. Por cada
molécula de DNA dentro
de la reacción tendremos
una molécula
fluorescente.

PCR en tiempo real o qPCR

Una de las primeras moléculas
fluorescentes usadas es SYBR
GREEN,

Al momento de desnaturalizar
esta molécula no interactúa
con el ADN, sin embargo,
cuando el primer ve completada
su hibridación, puede
interactuar con el surco
bicatenario

Etapas de la qPCR

Este gráfico se obtiene gracias
a un termociclador que irradia
la reacción con una longitud de
onda de 498nm, y en respuesta
el SYBR GREEN emite una
fluorescencia de 522nm

Resultados de la PCR en tiempo real

(Kim, 2001)

Hibridación in situ (FISH)

Basado en: (Wolf et al., 2015)

Hibridación in situ de mARN (FISH)

Usando hibridación in situ nos podemos preguntar; si un mARN específico está
presente o no, y, si está presente, dónde se encuentra localizado

RNA-seq

Podemos usar RNA-seq para medir la y usarla para medir la expresión
expresión génica en células normales... génica en células mutadas.

¿Para qué se usa?

Preparación de una librería

Alineamiento de la lectura a un genoma

Gráficos de resultados de RNA-seq

Ésta es una gráfica de
RNA-seq de células aisladas
para células neurales

Graficar los resultados nos
evidencia si podemos
encontrar diferencias
interesantes

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