MP: Priprava vzorcev in 2DGE_TTH

V pufer za pripravo celičnega lizata T.termophila dodamo CHAPS, ki:

• reducira disulfidne mostičke

• dobro raztaplja (tudi) hidrofobne proteine

• je kaotrop, ki poruši vse H-vezi

• je zwitterionski detergent

• omogoča lažje raztapljanje proteinov in njihovo razvitje

V pufer za izolacijo proteinov T.termophila dodamo DTT, ki:

• je spojina, ki oksidira disulfidne mostičke med in znotraj polipeptidov

• je detergent, ki pomaga pri raztapljanju hidrofobnih proteinov

• obd proteine z enakomernim nabojem na enoto dolžine

• je reducent, ki reducira disulfidne mostičke med in znotraj polipeptidov

V pufer za izolacijo proteinov T. termophila dodamo tudi mešanico proteaznih inhibitorjev Complete Mini, ki:

• inhibira delovanje vseh proteolitičnih encimov

• inhibira delovanje metalo in aspartatnih protaz

• inhibira delovanje serinskih in cisteinskih proteaz

• vsebuje EDTA, zato ne omogoča neposredne uporabe vzorca za afinitetno kromatografijo z imobiliziranimi kovinskimi ioni (IMAC)

• ne vsebujejo EDTA, zato ne inhibirajo od kovin odvisnih protaz in se lahko uporabljajo pri nadaljnjem čiščenju z IMAC

Za merjenje koncentracije proteinov v vzorcih smo uporabili metodo BCA, ki (glej prilogo- protokol proizvajalca):

• je dobro kompatibilna s prisotnostjo detergentov v vzorcu (npr do 5% CHAPSa)

• omogoča uporabo kelatorjev (EDTA, EGTA) v koncentracijah nad 1M

• je kompatibilna z reducentom DTT do koncentracije 1 mM.

• ob uporabi protokola za mikrotitrske plošče ob ustreznih pogojih omogoča določitev koncentracije proteinov med 20-2000 ug/ml

V vzorcih lizata T. termophila merite koncentracijo proteinov s testom BCA. Če se vam zgodi, da se v vaših vzorcih ne razvije nobena barva lahko (glej TS):

• je koncentracija proteinov previsoka (izven delovnega območja), zato morate vzorce redčiti

• sklepate, da vzorec vsebuje preveč lipidov (lipoproteinov), kar lahko rešite z dodatkom detergenta (2% SDS)

• pufer vsebuje reducent, ki ga je potrebno odstraniti z dializo/ultrafiltracijo

• sklepate, da vzorci vsebujejo kelator Cu, ki ga morate odstraniti z dializo/ultrafiltracijo, pomagate pa si lahko tudi z redčenjem vzorca in/ali povečanjem deleža bakra v delovni raztopini reagenta

V vzorcih lizata T. termophila merite koncentracijo proteinov s testom BCA. V vseh testnih mešanicah (tudi negativni kontroli, v katero niste dodali vzorca, ampak le pufer v katerem je ta raztopljen) se pojavi temno vijolična barva. Kaj sklepate?

• koncentracija proteinov v vzorcu je previsoka

• pufer vsebuje previsoko koncentracijo reducentov/tiolov ali biogenih aminov in zato ni kompatibilen z reagentom

• pH vrednost pufra ni ustrezna

• pufer vsebuje previsoko koncentracijo kelatorja

Zakaj celotni postopek izolacije proteinov izvajamo na ledu?

• da urea v vzorcu ne precipitira

• da se med sonikacijo vzorec preveč ne segreje in ne pride do razpada proteinov

• da ne pride do razpada DTT v izotiocianat, ki spremeni primarno zgradbo proteinov

• da ustavimo proteolitično aktivnost encimov sproščenih encimov

Po lizi in raztapljanju celičnih peletov testnih kultur TTH v izolacijskem pufru ste se lotili merjenje koncentracije proteinov. Rezultate merjenja absorbance različnih testnih vzorcev v mikrotitrski plošči najdete v Excellovem dokumentu Meritve_BCA. Za nadaljnje postopke (precipitacija ali FASP) potrebujete po 100 µg proteinov vsakega od testnih vzorcev. Izračunajte kakšno količino posameznega vzorca morate odvzeti (npr uporaiti za precipitacijo), da bo vsebovala ustrezno maso proteinov?

• MP15-1 = 21 µL, MP15-2 = 42 µL, MP18-1= 50 µL, MP18-2=71 µL, K= 61 µL

• MP15-1 = 210 µL, MP15-2 = 98 µL, MP18-1= 182 µL, MP18-2=191 µL, K= 274 µL

• MP15-1 = 820 µL, MP15-2 = 980 µL, MP18-1= 820 µL, MP18-2=910 µL, K= 740 µL

• MP15-1 = 82 µL, MP15-2 = 98 µL, MP18-1= 82 µL, MP18-2=91 µL, K= 74 µL

Za nadaljnje analize vzorca z 2DGE boste izvedli precipitacijo proteinov iz ustreznih volumnov vzorcev (vsak precipitat mora vsebovati 100 µg proteinov). Za postopek precipitacije velja:

• je najpogosteje uporabljen postopek izolacije proteinov v proteomiki

• je kritično odvisen od (ustrezno dolge) inkubacije pri dovolj nizkih temperaturah

• dobro poteka pri sobni temperaturi

• da proteine denaturiramo in precipitiramo s triklorocetno kislino, acetonom in DTT (najpogosteje)

• je do določene mere selektiven

Vzorce, ki jih boste ločili z 2DGE boste v naslednjem koraku raztopili v rehidracijskem pufru. Nastalo rehidracijsko raztopino boste nato uporabili za rehidracijo trakov za izoelektrično fokusiranje. Rehidracijski pufer:

• je namenjen zgolj navlaževanju trakov IPG (za izoelektrično fokusiranje)

• vsebuje CHAPS, UREO in DTT, ki ohranjajo razvito strukturo proteinov med rehidracijo in izoelektričnim fokusiranjem ter IPG pufer za lažje raztapljanje proeinov

• je potrebno uporabiti za vzpostavitev ustreznega 3D okolja za ločevanje proteinov, saj so IPG trakovi shranjeni v posušeni obliki

• lahko uporabimo tudi samostojno za predhodno rehidracijo IPG trakov, katerim naknadno dodamo vzorce.