Quy trình tạo dòng gen trong tế bào vật chủ là gì?

Cách gọi tên RE là gì?

Escherichia coli thì có tên là Eco, từ vi khuẩn Bacillus globigii thì viết là Bgl. Tên gọi enzyme hạn chế còn dùng bổ sung thêm phần sau (viết thẳng), tùy thuộc vào chủng vi khuẩn liên quan và tùy thuộc vào sự có mặt hay không của các yếu tố ngoài nhiễm sắc thể. Ví dụ RI trong E.coli: R viết tắt của chủng RY13, I là bậc xác định đầu tiên trong vi khuẩn. Vai trò của RE là gì?

Đặc điểm của RE là gì?

Vector chuyển gen là gì?

Các thành phần của một vector là gì?

Phân loại vector chuyển gen gồm những loại nào?

Plasmid: là những đoạn DNA ngắn (2-5 kb), dạng vòng, nằm ngoài NST, được tìm thấy đầu tiên ở vi khuẩn. Sự sao chép của plasmid không phụ thuộc sự sao chép của NST. Mỗi vi khuẩn có thể chứa hàng trăm plasmid. Loại vector này có thể nhận đoạn DNA có kích thước từ 8-9 kb.

Thế hệ đầu tiên: là các plasmid tự nhiên (ColE1, pSC101), ít các đặc tính cần thiết, không còn sử dụng nữa. Thế hệ thứ hai: là plasmid nhân tạo được cấu tạo phức tạp hơn, gồm nhiều gen có ích cho việc sử dụng. Plasmid thông dụng nhất là pBR322. Thế hệ thứ ba: Là các plasmid đa năng và chuyển dụng. Có MCS, DNA ngoại lai khoảng 3-10 kb.

Phản ứng cắt bằng enzyme cắt hạn chế. DNA: 2.0, EcoRI: 0.5, SalI: 0.5, Buffer 3.0: 1.0, H20: 6.0. Tổng: 10.0 μl. Hỗn hợp được ủ tại 37 độ C trong 3 giờ hoặc ủ qua đêm. Kiểm tra hiệu quả cắt bằng điện di agarose → nếu chưa đạt cần điều chỉnh cho phù hợp.

Đây là enzyme xúc tác cho phản ứng nối giữa hai đoạn DNA hay RNA. Có các loại ligase sau: T4 DNA ligase: li trích từ phage T4 xâm nhiễm E. coli; T4 polynucleotide kinase: li trích từ phage T4 xâm nhiễm E. coli; Alkaline phosphatase: li trích từ E. coli hay từ ruột bí.

Phản ứng lai đoạn chèn và vector backbone. Đoạn chèn >= 50 ng, Đoạn vector (4-5kb) >= 100 ng.

Nguyên lý: tế bào được ủ trong dung dịch CaCl2 để trở thành tế bào khả biến giúp chúng dễ tiếp nhận DNA plasmid.

Ion Ca2+ có khả năng tạo lỗ trên màng và gắn với phân tử DNA lên màng tb, đồng thời che dấu đầu tích điện âm của DNA. Đặc điểm này tạo đường cho DNA xuyên qua màng kỵ nước của tb.

Khi đặt hỗn hợp vào bể nhiệt ở 42oC, dòng nhiệt này tạo thành lực quét DNA vào trong tb. Sau 60s, hỗn hợp được nhanh chóng đặt vào bể đá, giúp các lỗ màng ngay lập tức đóng lại, giữ DNA trong tb.

Các tế bào được chọn lọc bằng phương pháp chọn lọc dương tính trên đĩa LB có chứa kháng sinh.

Hiệu suất biến nạp 10^4 - 10^6 thể biến nạp/μg plasmid tùy thuộc size của insert và chủng vi khuẩn sử dụng.

Phương thức để phân biệt giữa thể tái tổ hợp và tái tạo lại vòng: - Khử hoạ tính bằng chèn đoạn - Tạo dòng định hướng

DNA ngoại lai và DNA plasmid được thủy phân cùng một loại enzyme hạn chế và tinh sạch, sau đó gắn insert và backbone với nhau.

Phương thức này dùng cho plasmid có hai hay nhiều marker.

Phương thức này dùng cho plasmid có hai hay nhiều vị trí cắt hạn chế. DNA ngoại lai và plasmid được cắt bằng 2 enzyme cắt hạn chế.

Gắn insert vào backbone → thể tái tổ hợp dạng vòng mang tính kháng kháng sinh được dùng để biến nạp vào E.coli.

Operon lac ở E. coli. Ba gen cấu trúc lacZ, lacY và lacA nằm dưới sự kiểm soát của một vầng khởi động duy nhất (P) và được phiên mã cùng nhau dưới dạng mRNA liên tục.

Phage λ là một virus mang DNA sợi đôi có kích thước khoảng 50 kb, có khả năng xâm nhiễm và làm phân giải vi khuẩn?

DNA dạng mạch thẳng, có hai đầu bổ trợ mạch đơn dài 12 nu (dùng làm đầu cos) là gì?

Giai đoạn tiếp theo của phage λ có thể làm tan vật chủ hoặc gây ra hiện tượng gì?

Phage λ chứa vùng đệm (stuffer) có chiều dài bằng bao nhiêu phần trăm chiều dài của phage không có vai trò quan trọng trong quá trình sinh sản?

Đoạn gen ngoại lai được gắn vào giữa sao cho chiều dài của DNA tái tổ hợp nằm trong khoảng bao nhiêu phần trăm chiều dài của phage?

Phage λ được trang bị một hệ thống gì vào tế bào vi khuẩn?

Cosmid là các vector nhân tạo được ghép nối từ một plasmid với các trình tự đầu cos của phage λ.

Cosmid hoạt động như một plasmid và không phá vỡ tế bào vi khuẩn.

Hệ thống nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (bacterial artificial chromosome- BAC) dựa trên cơ sở gì?

Hệ thống nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (bacterial artificial chromosome-BAC) dựa trên cơ sở plasmid F-factor (thúc đẩy sự phân bố đồng đều của plasmid sau quá trình phân chia tế bào), có thể tái bản trong E.coli với các đoạn chèn có kích thước 100-300kb. Biến nạp bằng phương pháp xung điện. Hiệu suất tạo dòng cao, đoạn chèn thao tác dễ dàng, duy trì sự ổn định của các DNA được gắn vào vector. Ứng dụng: xây dựng thư viện, lập bản đồ và phân tích genome.

Hệ thống nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men (yeast artificial chromosome-BAC) là vector tạo dòng mạch thẳng dựa trên cấu trúc nhiễm sắc thể tự nhiên của nấm men. Tạo dòng những đoạn DNA có size lớn (150-1000 kb) YAC vector chứa 3 vùng trình tự quan trọng trong nấm men (chịu trách nhiệm nhân đôi và phân li): -TEL (telomeric sequence-trình tự đầu cuối của NST) -CEN (centromeric sequence-trình tự trung tâm của NST) -ARS (Autonomous Replicating sequence-trình tự sao chép tự chủ)

Dấu chuẩn chọn lọc như sinh tổng hợp uracil, histidine, leucine, và tryptophan được sử dụng như là gen chọn lọc dành cho các chủng nấm men dị dưỡng. Tạo dòng trong tế bào bậc cao thường vector trung chuyển (shuttle vector) vừa mang các yếu tố tạo dòng trong vi khuẩn, vừa chứa replicon và dấu chuẩn chọn lọc của nấm men→ lượng lớn vector được thu nhờ E. coli sẽ được biến nạp vào nấm men→ tiết kiệm thời gian và chi phí

Thư viện bộ gen (genomic library) - Là tập hợp tất cả các trình tự DNA cấu thành bộ gen đã được gắn vào vector. • Cách thiết lập • Tách chiết DNA bộ gen→ cắt DNA thành những đoạn có kích thước xác định bằng RE→ gắn vào vector tth→ biến nạp vào tế bào chủ→ các tế bào được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc. Thư viện bộ gen (genomic library) - Ứng dụng: - Giải mã thông tin di truyền chứa trong bộ gen, đặc biệt là cấu trúc intron-exon của một gen xác định - Tạo dòng các trình tự DNA không mã hóa nằm cạnh gen và đóng vai trò quan trọng trong sự điều hòa.

Giải mã thông tin di truyền chứa trong bộ gen, đặc biệt là cấu trúc intron-exon của một gen xác định.

Thư viện cDNA là tập hợp bản sao cDNA từ tất cả các mRNA của một tế bào.

Giới thiệu chung về các kỹ thuật cải tiến protein.

Phương pháp truyền thống để chọn lọc giống cây trồng.

Phương pháp hiện đại trong thiết kế cấu trúc protein.

Phương pháp phát sinh đột biến điểm định hướng

Đột biến điểm định hướng sử dụng DnpI

Đột biến điểm bằng mở rộng chồng lấp đơn

Saturation mutagenesis

Cách thực hiện phương pháp này sử dụng các đoạn primer thoái biến (degenerate primer) được tổng hợp như NNN, NNK hay NNS.

Khi sử dụng primer thoái biến ở dạng NNN, sẽ có xuất hiện 64 bộ ba m„ hÛa có thể được tạo ra từ việc kết hợp ngẫu nhiên các nucleotide lại với nhau.

Các primer thoái biến NNN không phải là lựa chọn lý tưởng do trong 64 bộ ba mã hóa tạo ra có đến ba bộ ba kết thúc.

Tăng độ bền nhiệt của pyranose 2-oxidase (P2O) là gì?

Enzyme P2O từ Trametes multicolor có đặc điểm gì?

Vị trí Glu542 (E542) đóng vai trò gì trong enzyme P2O?

Biến thể E542K đã làm tăng độ bền nhiệt lên bao nhiêu độ C?

Cấu trúc tinh thể của enzyme có vai trò gì?

Hai vị trí E542 và L537 nằm ở đâu?

Saturation mutagenesis đã tìm thấy những biến thể nào?

Biến thể kép L537W/E542K có hiệu quả xúc tác và độ bền nhiệt như thế nào?

Thể hiện hiệu quả xúc tác và độ bền nhiệt cao hơn đáng kể so với chủng tự nhiên (thời gian bán sống của biến thể này ở 70oC là 104.9 phút, so với 0.4 phút của chủng tự nhiên).

Tăng độ bền nhiệt của pyranose 2-oxidase (P2O) → biến thể kép L537W/E542K tăng cường tương tác kỵ nước giữa Trp537 của tiểu đơn vị A và Gln539 của tiểu đơn vị C. Sự sắp xếp này làm rút ngắn liên kết hydro giữa hai amino acid này, và làm cho nó bền vững hơn.

Lựa chọn thư viện DNA mà hóa cho protein đích.

Tạo thư viện đột biến bằng các phương pháp như error-prone PCR, DNA shuffling.

Trình tự DNA mới được gắn vào vector, biến nạp và biểu hiện protein đích.

Sàng lọc các biến thể chứa trình tự đột biến có đặc tính cải thiện.

Lý thuyết của Darwin: Sự thay đổi lội qua thời gian và không gian.

Tất cả các loài có cùng một nguồn gốc chung.

Sự tiến hóa diễn ra dần dần với tốc độ rất chậm.

Cơ chế chọn lọc qua thời gian là sự chọn lọc tự nhiên.

Tiến hóa có định hướng: bắt chước thuyết tiến hóa của Darwin nhưng đưa các đột biến ngẫu nhiên một cách nhân tạo.

Định hướng: lựa chọn các đặc tính có lợi một cách có chủ đích.

Bước 1: tạo thư viện đột biến từ chủng tự nhiên.

Bước 2: sàng lọc thư viện.

Bước 3: tạo thư viện đột biến mới từ 10 đột biến đã chọn.

Bước 4: sàng lọc thư viện...

Sau mỗi vòng, biến thể mang đặc tính cải thiện hơn.

Một chiến dịch cùng nghệ được sử dụng để cải tiến chức năng của protein thông qua nhiều vùng đột biến và lựa chọn lặp lại.

Khoảng 0.1 – 1% tất cả các đột biến ngẫu nhiên là có lợi.

Dựa trên lý thuyết tiến hóa tự nhiên, nhưng được thực hiện với tốc độ nhanh hơn nhiều.

Tiến hóa định hướng và thiết kế có chủ đích: thiết kế có chủ đích là thay đổi chức năng protein dựa trên hiểu biết về sự thay đổi đó.

Tiến hóa định hướng: tạo thư viện các biến thể chưa đặc tính mong muốn.

Các phương pháp trong Tiến hóa định hướng: Error prone PCR, DNA shuffling, ITCHY.

Error-prone PCR: Định nghĩa: Phản ứng PCR dưới điều kiện cảm ứng là một tăng mức độ tạo ra lỗi sao chép của DNA polymerase.

Định nghĩa: Phản ứngPCR dưới điều kiện cảm ứngl‡mtăng mứcđộ tạora lỗisao chÈpcủaDNA polymerase

MụctiÍu: tạora 1-3 biến thểtrÍn 1 kb

Enzyme Technology 4.2

Considerable interest in improving a xylose isomerase-based pathway inS. cerevisiaewith a particular focus on improving boththe cell growth rate and the xylose consumption rate

Xylose isomerase là một enzyme quan trọng cho ngành thực phẩm, đặc biệt trong sản xuất siro ngô fructose cao (HFCS). Mục tiêu là cải thiện hoạt động enzyme cụ thể dưới các điều kiện đã thử nghiệm, tăng trưởng tế bào, tỷ lệ tiêu thụ xylose và sản xuất ethanol trong nấm men S. cerevisiae bằng cách tiếp cận tiến hóa có định hướng.

So sánh tỷ lệ tăng trưởng tương đối của các đột biến đã chọn. Tỷ lệ tăng trưởng của các chủng được phân lập trong các vòng đột biến đầu tiên, thứ hai và thứ ba (μ*) được so sánh với tỷ lệ của loại hoang dã (μo).

Site-directed mutagenesis của các đột biến đã xác định: để xác nhận các đột biến có lợi trong đột biến xylose isomerase. Một loạt sáu đột biến ngược riêng lẻ đã được thực hiện bằng cách sử dụng đột biến xylose isomerase vòng ba (xylA*3).

Các đột biến tại vị trí axit amin 15 và 142 là quan trọng.

Mục tiêu: tạo ra các biến thể chitinase với các tính chất sinh hóa cải thiện.

Kết quả: 5 biến thể cho thấy hoạt động tương đối cao ở pH 3.0.