Clase 3.1_ Cuantificación y análisis estructural de proteínas

Cuantificación y análisis

estructurales de interacciones y

secuencias proteicas

Biología Molecular II
PhD. Caroline Bacquet

Se utiliza principalmente el método de
“Salting out”, donde el principal
reactivo es el sulfato de amonio.

La sal neutra comprime la capa de
solvatación y hace que las proteínas
precipiten, permitiendo extraer el
supernadante para una siguiente etapa
de purificación o detección.

Precipitación

La precipitación consiste en la separación de proteínas de los

contaminantes presentes en las células y espacios extracelulares.

Espectroscopía UV

Los residuos de tirosina y triptófano en las proteínas presentan un pico máximo de

absorción en 280 nm. Gracias a ello, es posible utilizar mecanismos de espectroscopía para
detectar la presencia de proteínas. Tiene ventajas al ser un método no destructivo de las

proteínas. Puede presentar interferencias como la presencia de ácidos nucleicos.

Método de Bradford

El método de Bradford involucra la utilización del Azul de Coomassie, que se une a las
proteínas de una mezcla a evaluarse. En pH bajo, el reactivo tiene absorbancias máximas en
470 y 650 nm, pero al unirse a una proteína presenta absorbancias en 595 nm.

Método de Kjeldahl

El método de Kjeldahl consiste en una serie de pasos que permiten medir el

contenido de nitrógeno en un compuesto. Es utilizado para analizar el contenido

proteico de sólidos complejos y muestras microbiológicas.

Tipos de estructura

La estructura primaria se analiza la
cadena de aminoácidos que conforman un
péptido.

En la estructura secundaria se
determinan las alfa hélice y hoja beta.

La estructura terciaria estudia las
atracciones entre alfa hélices y hojas beta.

La estructura cuaternaria determina la
conjunción de varias cadenas peptídicas,
que forman multímeros.

Electroforesis: SDS-PAGE

Se agrega:

SDS➔Destruye enlaces de
hidrógeno, interacciones
iónicas e hidrofóbicas,
adicionalmente se adhiere a la
proteína, dándole una carga
negativa y le facilita adoptar
una forma lineal.

β-mercaptoetanol➔rompe
enlaces disulfuro.

¿Cómo se preparan las proteínas?

(Humeco, 2020), (Puerta et al., 2015)

¿Cómo funciona?

Las proteínas son
separadas en un gel de
poliacrilamida basados en
su peso molecular.

Las moléculas pequeñas
migran relativamente más
rápido

Western Blot

El mecanismo de Difusión Simple consiste en
ubicar el gel sobre la membrana y un taco de
papeles con filtro que permiten la transferencia.

El mecanismo de Transferencia la vacío utiliza
una bomba con sistema de secado de planchas
de gel, la cual lleva las proteínas hasta la
membrana de nitrocelulosa.

Finalmente, el mecanismo de
Electrotransferencia permite transferir las
proteínas hasta la membrana a través de una
corriente de carga eléctrica.

Western Blot: Transferencia

Western Blot

Es una técnica molecular de
detección de proteínas que
permite identificar una proteína
de interés o varias proteínas, a
partir del uso de un anticuerpo
específico.

Se acopla a la técnica de
SDS-PAGE de separación de
proteínas. Para la transferencia se
utilizan tres mecanismos, donde
se transfiere a una membrana
contenedora de los anticuerpos.

Tras la transferencia, las
bandas resultantes son efecto
de la reacción entre el
anticuerpo y la proteína o
proteínas de interés.

La reactividad
proteína-antígeno puede ser
principalmente observada a
través de fluorescencia y
actividad enzimática.

Western Blot: Resultados

Dicroismo Circular

Es una técnica espectroscópica de
absorción que provee información acerca
de la estructura. Se expresa
frecuentemente como la propiedad que
poseen algunos materiales de absorber la
luz a diferentes grados dependiendo de la
forma de polarización del haz incidente.

●Determinación de la estructura
secundaria de proteínas

●Estudios conformacionales de proteínas
y péptidos

●Estudios de desnaturalización química o
térmica de proteínas

Cristalografía de Rayos X

Es una técnica que permite determinar la
estructura atómica y molecular de un
cristal u objeto cristalizado.

La estructura cristalina hace que un haz de
rayos X se difracte en muchas direcciones
específicas. Al medir los ángulos e
intensidades de los rayos difractados se
puede obtener una imagen tridimensional.

Las estructuras cristalinas de rayos X brindan
información de la estructura terciaria de
las proteínas, también pueden explicar las
propiedades electrónicas o elásticas inusuales
de un material.

Resonancia Magnética Nuclear (NMR)

Es un fenómeno físico en el cual los núcleos atómicos son perturbados por oscilaciones débiles

de campo magnético y responden produciendo una señal electromagnética a una frecuencia

característica. Es altamente utilizado para determinar estructuras moleculares orgánicas.

Resonancia Magnética Nuclear (NMR)

Cryo-Microscopía electrónica:

lo mejor de dos mundos

Murata and Wolf, 2018

Microscopía de fuerza atómica

Permite observar a una escala molecular
y atómica.

Al tratarse de proteínas, se ha utilizado
para detectar propiedades de proteínas en
solución, así como de otras propiedades
singulares de biomoléculas.

Se ha podido observar la topografía de la
proteína, permitiendo detectar su medida
y cantidad de proteínas en una misma
muestra.

(Pleshakova et al., 2020 & Ivanov., 2018)

Co-inmunoprecipitación

03

Determinación de interacciones entre proteínas

Co-inmunoprecipitación, marcaje inmunofluorescente, FRET/FRAP.

Inmunoprecipitación

Utiliza la especificidad del anticuerpo para aislar una proteína

particular (antígeno) de una mezcla de muestra compleja.

Co-inmunoprecipitación

Esta técnica es la mejor manera de comprobar si dos proteínas están

interactuando entre sí in vivo.

Co-inmunoprecipitación

Se realiza una inmunoprecipitación, con la presunción de que la proteína objetivo,
interactúa con otra proteína. Se marca y precipita una sola proteína, en el momento

de analizar, se confirma la presencia de una segunda.

Resultados de co-inmunoprecipitación

Con los resultados del
Western Blot, se puede
confirmar la interacción
entre estas dos proteínas,
por la visualización de dos
bandas, o en su defecto,
descartar dicha
interacción tras observar
una sola banda.

Tinción Inmunofluorescente

Esta técnica utiliza como principio las reacciones antígeno-anticuerpo que se pueden visualizar
utilizando técnicas de microscopía. El método indirecto presenta mayor sensibilidad ya que
más de un anticuerpo fluorescente puede ser enlazados al anticuerpo primario

(Humeco, 2020), (Puerta et al., 2015)

FRET y FRAP

Fluorescence recovery after
photobleaching (FRAP) es
una técnica de apagado de
fluorescencia que permite
detectar interacciones proteicas.

Fluorescence resonance energy transfer
(FRET) es una técnica donde la luz de
excitación de una molécula
fluorescente (el donante) es absorbida
por una molécula aceptora, en el caso
de que se encuentre muy próxima.

04

Determinación de tamaño, composición y secuencia

Espectrometría de masas

Espectrometría de masas de péptidos de proteínas

¡Gracias!