Clase 3.2 Inmunoensayos

Sabuesos moleculares:
Detección inmunoquímica
de proteínas

Biología Molecular II
PhD. Caroline Bacquet

Utilidad de anticuerpos

Detectar una proteína específica entre miles en una célula es como buscar una aguja en un pajar. Para lograrlo, los científicos utilizan herramientas precisas: los anticuerpos, verdaderos sabuesos moleculares capaces de reconocer con alta especificidad a su objetivo, el antígeno.

En esta clase exploraremos cómo se utilizan estas moléculas en técnicas de detección inmunoquímica como el Western blot, la inmunoprecipitación y la inmunofluorescencia, fundamentales en investigación biomédica, diagnóstico y biotecnología.

Los anticuerpos (inmunoglobulinas, Ig) son glicoproteínas en forma de Y producidas por las células B como parte del sistema inmunitario. Se unen específicamente a moléculas llamadas antígenos.

Cada anticuerpo está compuesto por cuatro cadenas polipeptídicas:

• 2 cadenas pesadas (H)

• 2 cadenas ligeras (L)

Estas forman dos regiones principales:

• Región variable (V o F(ab)): Se encuentra en los extremos superiores de la Y y reconoce específicamente el epítopo del antígeno.

• Región constante (C o Fc): Se localiza en la base de la Y y participa en la activación de la respuesta inmune.

Investigación biomédica

• Identificación de proteínas específicas en tejidos o cultivos celulares.

• Seguimiento de procesos fisiológicos como diferenciación, apoptosis o proliferación.

Diagnóstico clínico

• Detección de biomarcadores de enfermedades (por ejemplo, oncogenes o proteínas virales).

• Diagnóstico de enfermedades infecciosas mediante test rápidos basados en anticuerpos (como ELISA o pruebas rápidas de antígenos).

Biotecnología y desarrollo farmacéutico

• Control de calidad en la producción de proteínas recombinantes.

• Verificación de pureza y actividad de proteínas terapéuticas.

Ingeniería genética y celular

• Verificación de la expresión de proteínas en organismos modificados genéticamente.

• Validación funcional de proteínas fusionadas (como GFP o etiquetas epítopo).

Ciencias ambientales y forenses

• Detección de contaminantes o patógenos en muestras ambientales.

• Identificación de trazas biológicas en investigaciones forenses.

​Anticuerpos policlonales

Son una mezcla de anticuerpos que reconocen diferentes epítopos de un mismo antígeno. Se obtienen inmunizando un animal, recolectando su suero y, opcionalmente, purificándolo por afinidad.

Ventajas:

• Alta sensibilidad al reconocer múltiples epítopos.

• Generan una señal fuerte en aplicaciones diagnósticas o experimentales.

Desventajas:

• Variabilidad entre lotes.

• Producción limitada.

• Riesgo de reactividad cruzada con otras proteínas.

Preparación de anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales se producen a partir de hibridomas, que resultan de fusionar células de mieloma con células inmunizadas. Estas células híbridas se seleccionan según el anticuerpo que producen y luego se purifican.

​ELISA es una técnica en placa que detecta y cuantifica antígenos mediante la unión específica antígeno-anticuerpo. El antígeno se inmoviliza en la superficie, se añaden anticuerpos marcados y la señal generada es proporcional a la cantidad de antígeno presente.

El ELISA directo usa un anticuerpo primario con enzima que se une directamente al antígeno. Es rápido y con menos pasos, pero menos sensible. Se usa para detectar antígenos abundantes con anticuerpos bien caracterizados.

En el ELISA indirecto, un anticuerpo primario reconoce al antígeno y un anticuerpo secundario con enzima se une al primario. Este método amplifica la señal y es ideal para detectar anticuerpos en suero y estudiar respuestas inmunológicas.

El ELISA tipo sándwich utiliza dos anticuerpos para atrapar al antígeno entre ellos, lo que brinda alta especificidad y sensibilidad. Es ideal para detectar antígenos en bajas concentraciones en muestras complejas.

El ELISA competitivo mide antígenos pequeños haciendo que compitan con un antígeno marcado por la unión al anticuerpo. A mayor cantidad de antígeno en la muestra, menor es la señal. Es útil para detectar hormonas, fármacos o toxinas.

Western blot

El Western blot (también conocido como inmunoblot) es una técnica ampliamente utilizada para la detección, identificación y cuantificación de proteínas específicas en una muestra compleja. Combina la separación electroforética de proteínas por tamaño con la detección inmunológica específica mediante anticuerpos.

Separación por SDS-PAGE:

Las proteínas de la muestra se denaturan y se separan según su peso molecular mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida con SDS.

Transferencia a una membrana:
Las proteínas separadas se transfieren del gel a una membrana de nitrocelulosa o PVDF, donde quedan adheridas y accesibles para los anticuerpos.

Bloqueo:

Se bloquean los sitios no específicos de la membrana con una solución proteica (como leche en polvo o BSA) para evitar la unión inespecífica de anticuerpos.

Incubación con anticuerpos:

Se aplica un anticuerpo primario específico para la proteína de interés. Luego se añade un anticuerpo secundario, unido a una enzima (como HRP), que reconoce al anticuerpo primario.

Inmunoprecipitación

1. Inmunoprecipitación (IP):
   Técnica que permite aislar y purificar proteínas específicas o complejos proteicos usando anticuerpos unidos a soportes sólidos (como perlas magnéticas o de agarosa) para capturar antígenos desde mezclas celulares.

2. Inmunoprecipitación de Cromatina (ChIP):
   Método que detecta si una proteína se une a una región específica del ADN en células vivas, permitiendo estudiar la regulación génica y la interacción proteína-ADN a nivel genómico.

Inmunohistoquímica

Aunque menos cuantitativa que técnicas como ELISA o Western blot, la IHC permite visualizar la localización de proteínas dentro del contexto tisular. Utiliza anticuerpos específicos y sistemas de detección cromogénicos o fluorescentes para revelar la unión al antígeno.

Detección:

La enzima del anticuerpo secundario cataliza una reacción (generalmente quimioluminiscente o colorimétrica) que revela la ubicación y cantidad de la proteína específica.

Inmunocitoquímica

Técnica utilizada para analizar la localización subcelular de proteínas en células cultivadas.
Las células se fijan y permeabilizan, y luego se aplican anticuerpos marcados con fluoróforos, lo que permite estudiar la colocalización de proteínas mediante microscopía de fluorescencia (campo amplio, confocal o disco giratorio).

Dispositivo de flujo lateral (LFD)

​Son pruebas rápidas y portátiles (como los test de embarazo o COVID-19) que detectan la presencia de proteínas específicas en una muestra. Utilizan anticuerpos inmovilizados sobre una tira de nitrocelulosa que captura el antígeno, generando una señal visible (generalmente una línea coloreada) si el resultado es positivo.

1. Aplicación de la muestra: Se coloca una muestra líquida (sangre, saliva, orina, etc.) en el extremo de la tira reactiva.

2. Migración por capilaridad: La muestra fluye lateralmente a lo largo de la tira por acción capilar.

3. Zona de conjugado: Aquí la muestra se encuentra con anticuerpos marcados (generalmente con oro coloidal o enzimas) que reconocen el antígeno de interés. Si el antígeno está presente, se forma un complejo antígeno-anticuerpo marcado.

4. Zona de prueba: Este complejo migra hasta una línea donde hay anticuerpos inmovilizados que capturan específicamente el complejo. Si el antígeno estaba presente, aparece una línea visible (resultado positivo).

5. Zona de control: Independientemente del resultado, esta zona atrapa los anticuerpos marcados libres para confirmar que el dispositivo funcionó correctamente (debe aparecer una segunda línea).

​FACS
Citometría de flujo con marcaje fluorescente

Anticuerpos terapéuticos

Están diseñados para unirse específicamente a moléculas asociadas a enfermedades. Se usan en tratamientos de cáncer, enfermedades autoinmunes e infecciones. Actúan bloqueando receptores, neutralizando toxinas o dirigiendo fármacos a células específicas. Son efectivos y con menos efectos secundarios.
Algunos ejemplos son los sueros antiveneno
o ciertos anticuerpos utilizados para tratar enfermedades como el cáncer.

Manejo, alicuotado y almacenamiento de anticuerpos conjugados

​Sondas fluorescentes (p. ej., Alexa Fluor®, Dylight®, FITC, PE)

HRP (Peroxidasa de rábano picante)

Manejo

• Alicuotar inmediatamente al recibir el anticuerpo.

• Evitar ciclos de congelación/descongelación.

• Almacenar en recipientes oscuros o protegidos de la luz UV.

Almacenamiento a largo plazo

• Seguir las recomendaciones de la hoja técnica del fabricante.

• Almacenar a -20°C si contiene un crioprotector (p. ej., glicerol).*

• Utilizar viales ámbar o tubos cubiertos con papel aluminio para proteger de la luz.

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Almacenamiento a corto plazo

• Conservar a +4°C para almacenamiento a corto plazo (1-2 semanas).

Multiple Choice

Reacción en la que anticuerpos específicos (sueros) actúan contra toxinas, virus o enzimas, impidiendo que ejerzan su efecto tóxico.

• Afinidad

• Electroforesis

• Aglutinación

• Neutralización

Multiple Choice

Los inmunoensayos se usan para detectar

• Drogas

• Hormonas

• Marcadores tumorales

• Todas las anteriores

Multiple Choice

Las pruebas de embarazo son inmunoensayos

• Verdadero

• Falso

Multiple Choice

Para ser útiles en los inmunoensayos, los anticuerpos deben hacerse visibles.

• Verdadero

• Falso

Multiple Choice

¿Qué caracteriza la citometría de flujo?

• Las mediciones se realizan sobre un grupo de células

• No permite analizar subpoblaciones celulares

• Las mediciones se realizan sobre cada una de las células

• Es una técnica muy subjetiva

Multiple Choice

¿Qué tipo de medición se realiza en la citometría de flujo?

• Dispersión frontal

• Dispersión lateral

• Fluorescencia emitida

• Todas son correctas

Multiple Choice

Las técnicas de inmunología se basan sólo en la detección de los anticuerpos de una determinada patología

• Verdadero

• Falso

Multiple Choice

En las técnica de ELISA, el marcador usado es:

• Fluoróforo

• Nanopartícula coloreada

• Enzima

• Isótopo radioactivo

Multiple Choice

El siguiente enunciado corresponde a la definición de ELISA: Técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno (Ag) inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo (Ac) enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable, como cambio de color o algún otro tipo.

• Falso

• Verdadero

Multiple Choice

A que tipo de ELISA corresponde la siguiente imagen

• Directo

• Indirecto

• Sándwich

• Competitivo

Multiple Select

Los anticuerpos marcados con fluorescencia se utilizan en las células principalmente para localizar

• Secuencia de ADN

• Secuencia de ARN

• Proteína

Multiple Choice

¿Cuáles son las ventajas de los anticuerpos monoclonales frente a los policlonales?

• Pueden producirse en mayores cantidades.

• Pueden producirse con mayor pureza.

• Tienen una especificidad más uniforme.

• Pueden fabricarse contra moléculas que constituyen sólo un componente menor de una mezcla compleja.

• Todas las anteriores.

Multiple Choice

¿Cuál de los siguientes métodos cromatográficos se asemeja a la inmunoprecipitación?

• Cromatografía de intercambio iónico

• Cromatografía de filtración en gel

• Cromatografía de interacción hidrofóbica

• Cromatografía de afinidad

Multiple Choice

En el SDS-PAGE de proteínas,

• Las proteínas se despliegan mientras migran en el gel

• Las proteínas se separan por tamaño, sin importar su carga nativa

• Las proteínas grandes se mueven más lentamente

• Se utiliza un detergente iónico

• Todas las anteriores

Multiple Select

Si queremos detectar un anticuerpo primario hecho en cabra, en cuál especie puede estar hecho el anticuerpo secundario

• cabra

• burro

• conejo

• ratón

Multiple Choice

Una proteína de referencia para Western blot debería contar con la siguiente condición

• Estar presente en todas las especies del reino animal

• Ser una proteína difícil de degradar

• Tener niveles de expresión constante en distintos tejidos y en diferentes condiciones

• Tener una intensidad mediana de fluorescencia para así no dañar los promedios

Multiple Choice

¿Qué detecta la prueba de Western Blot?

• glóbulos blancos

• defensas

• proteínas

• secuencia de ADN

Multiple Select

Célula creada para la producción de anticuerpos monoclonales:

• Linfocito B

• Hibridoma

• Mieloma

• Linfocito T

Multiple Choice

Prueba de laboratorio en la que se utilizan anticuerpos acoplados a peroxidasa sobre tejidos fijados:

• Hemaglutinación

• Inmunofluorescencia

• Inmunohistoquímica

• ELISA

Multiple Choice

El epítope forma parte del anticuerpo:

• Cierto

• Falso

Multiple Choice

¿Cuál es la parte del anticuerpo que se une a un antígeno específico?

• Fragmento variable

• Fragmento constante

• Bisagra

• Fc

Multiple Choice

El suero contra veneno de serpiente es un ejemplo de anticuerpos terapéuticos

• Verdadero

• Falso